1、PD1+肿瘤浸润性 CD8+T淋巴细胞的表型鉴定及功能研究李小红，陈 陵，朱 波 (400037 重庆，第三军医大学新桥医院全军肿瘤诊治研究所 )摘要 目的 从肿瘤局部分离衰竭性 CD8+T 淋巴细胞（CD8 + PD1+T cell） ，并对其功能进行研究。初步探讨机体免疫系统无法有效杀伤和清除肿瘤的原因。方法 C57BL/6 小鼠 皮下注射 Lewis 肺癌细胞株建立小鼠肿瘤模型。将肿瘤制成单细胞悬液后，染细胞表面标志。采用流式细胞术从肿瘤局部分选 CD8+PD1+T 淋巴细胞及 CD8+PD1-T 淋巴细胞，体外经非特异性刺激后行细胞内因子染色，检测 IFN- 分泌能力。CFSE 细胞染
2、色检测其增殖活性。结果 肿瘤局部成功分离得浸润性 CD8+T 淋巴细胞，其中将近 80%的细胞高表达衰竭表型 PD1+。CFSE 结果显示 CD8+PD1+T cell较 CD8+PD1-T cell 增殖活性明显下降；细胞内因子染色后流式细胞术检测结果显示肿瘤局部 CD8+PD1+T cell 较CD8+PD1-T cell IFN- 分泌能力降低约 50%。结论 肿瘤局部存在一群免疫衰竭性 T 细胞，可能参与了肿瘤的免疫逃逸。关键词 肿瘤；T 淋巴细胞；PD1中图法分类号 R392.12；R73-35+4；R730.3 文献标志码 AIdentification of tumor-infi
3、ltrating CD8+PD1+ T-lymphocytes in Lewis lung cancerLi Xiaohong, Chen Ling, Zhu Bo (Cancer Center of PLA, Xinqiao Hospital, Third Military Medical University, Chongqing, 400037, China)Abstract Objective To identify the biological function of tumor-infiltrating CD8+PD1+ T-lymphocytes in Lewis lung ca
4、ncer. Methods The implanted tumor model was established by subcutaneous injection of Lewis lung cancer cells into C57BL/6 mice. CD8+PD1+ T-lymphocytes and CD8+PD1- T-lymphocytes were isolated from transplanted tumors by flow cytometry and labeled with CFSE to follow their proliferation. The IFN- lev
5、el in isolated cells was analyzed by intracellular cytokine staining. Results CD8+ T-lymphocytes existed in transplanted tumors. Some of those CD8+ T-lymphocytes also expressed PD-1, which has been identified as a marker of exhausted T cells. In comparison with CD8+PD1- T-lymphocytes, the proliferat
6、ion rate of CD8+PD1+ T-lymphocytes significantly decreased and the IFN- secretion was suppressed. Conclusion The tumor-infiltrating CD8+ T-lymphocytes that express PD-1 do not have normal function, which may be the reason for tumor-infiltrating lymphocytes not killing tumor cells effectively.Key wor
7、ds tumor; T lymphocyte; PD-1Corresponding author: Zhu Bo, E-mail: oncology_通信作者 朱 波，E-mail: oncology_优先出版 http:/ 17:41）机体 T 细胞免疫在控制肿瘤的发生、发展过程中起到了重要作用 1-4。其中肿瘤局部浸润性 CD8+ T 淋巴细胞在机体抗肿瘤免疫应答中发挥了关键作用。近年来发现，肿瘤患者体内存在免疫抑制机制 5，妨碍机体对肿瘤的清除，导致肿瘤长期定植，表现为 T 淋巴细胞功能障碍与增殖能力减弱 6。PD1 已被公认为是衰竭性 T 淋巴细胞的表面标志 7。阻断PD1-PD1L
8、通路可以部分恢复衰竭性 T 细胞的功能 8-10。为确认肿瘤局部是否存在衰竭性 T 淋巴细胞，并进一步研究其功能特点，揭示肿瘤在体内长期定植的原因，本研究通过小鼠皮下注射 Lewis 肺癌细胞株，建立了小鼠肿瘤模型；从肿瘤局部分离得到CD8+PD1+T cell，并对细胞自身特点与功能做了初步探讨。1 材料与方法1.1 细胞培养Lewis 肺癌细胞株（购自中国科学院上海细胞库）DMEM(High Glucose)培养基（含 10%胎牛血清）培养 34 d，胰酶（购自 Hyclone）消化后制成单细胞悬液，调整细胞浓度为 5107/mL。1.2 建小鼠肿瘤模型雌性 C57BL/6 小鼠，SPF
9、级，68 周龄， 体质量(222)g，购自重庆医科大学实验动物中心。所有动物实验经第三军医大学实验动物管理及伦理委员会审核通过。实验分实验组和对照组，每组 5 只小鼠。实验组小鼠双上肢腋下注射 Lewis 肺癌细胞，210 7细胞/只。对照组以培养基代替。同样方法注射。1.3 TIL(肿瘤浸润性 T 淋巴细胞)的制备实验组小鼠注射肺癌细胞后 3 周，无菌条件下取 Lewis肺癌移植瘤标本，除去黄色脂肪组织及血块置于含双抗的PBS 中浸泡 5 min（使用含双抗的 PBS 目的是为了尽量保证无菌，避免污染） ，充分剪碎，研磨制成单细胞悬液，经小鼠淋巴细胞分离液密度梯度离心后收集白膜层， DMEM
10、 培养基重悬，置入 250 mL 细胞培养瓶，37，5% C02培养箱贴壁 3 h。收集未贴壁细胞，其中即含有肿瘤浸润性 T 淋巴细胞。1.4 流式抗体与细胞分选抗小鼠 CD8 抗体（APC） ，抗小鼠 PD1 抗体（PE） ，抗小鼠IFN- 抗体（PE-CY7）及同型对照均购自 BD 公司。未贴壁细胞经 CD8-APC、PD1 -PE 抗体 4 30 min 染色后，经 BD FACSAria 流式细胞仪分选得 CD8+PD1+T cell 和 CD8+PD1-T cell。1.5 CFSE 染色参考 Quah 等 11的染色方案进行。CFSE 终浓度为1mol/L。CFSE 染色后细胞铺与
11、 96 孔平底板，5 000/孔。CD3 抗体 5 g/mL，CD28 抗体 2 g/mL，mIL-2 10 U/mL 37体外刺激 0、1、3、5、7 d 后分别进行流式检测。设不染色空白对照孔。1.6 细胞内因子染色（ICS）CD8+PD1+ T cell 和 CD8+PD1- T cell 体外经 PMA（终浓度 50 ng/mL） 、离子霉素（终浓度 1g/mL）刺激 5 h 后采用标准程序染细胞内因子 IFN- 12。细胞内因子染色试剂盒购自 BD 公司。1.7 统计学分析计量资料以 xs 表示，采用 SPSS 13.0 统计软件。组间差异方差齐采用单因素方差分析；方差不齐采用秩和检
12、验。2 结果2.1 肿瘤局部浸润性 CD8+T 细胞分离与鉴定为确定肿瘤局部是否存在浸润性淋巴细胞，肿瘤局部分离得单个核细胞后染 CD8+表型，发现确存在肿瘤浸润性CD8+T 淋巴细胞（图 1A） ，为进一步明确 CD8+T 细胞亚群，复染 PD1，发现存在一 CD8+T 细胞亚群高表达衰竭性表型PD1（图 1B） 。2.2 CD8+PD1+T cell 在不同 组织中的分布为进一步明确衰竭性表型 PD1 是否仅表达于肿瘤浸润性CD8+T 细胞表面，将荷瘤小鼠和正常小鼠脾脏研磨制成单细胞悬液，染色后流式分析。比较 CD8+PD1+ T cell 在不同组织部位分布。结果发现 CD8+PD1+T
13、 cell 主要存在于肿瘤局部，荷瘤小鼠脾脏中也有一定的分布，而在正常小鼠的脾脏中几乎不存在（图 2） 。A BA：肿瘤局部单个核细胞，单染 CD8；B：CD8+ T 细胞复染 PD1图 1 肿瘤局部 CD8+ T细胞亚群分析A BA:流式细胞分析；B: CD8 +PD1+ T 细胞在不同组织部位中的分布图 2 不同组织 CD8+PD1+T细胞比例分布2.3 CFSE 检测细胞增殖情况为确认肿瘤浸润性 CD8+PD1+T 淋巴细胞的增殖活性是否已发生变化，流式分选 CD8+PD1+T cell 和 CD8+PD1-T cell 分别标记 CFSE，同时设不染色空白对照。分别在 0、1、3、5、
14、7 d 进行流式检测。结果发现 CD8+PD1+T 细胞的增殖能力（图3B）较 CD8+PD1-T 细胞（图 3A）明显下降。2.4 检测 CD8+PD1+和 CD8+PD1-两群细胞 IFN-分泌功能分选后 CD8+PD1+T cell 和 CD8+PD1-T cell，体外经 PMA和离子毒素非特异性刺激 5 h 后，行细胞内因子染色，流式检测其 IFN- 的分泌功能。发现 CD8+PD1+ T 细胞 IFN- 分泌能力明显降低（图 4A、B） 。统计分析显示，荷瘤小鼠肿瘤局部 CD8+PD1-T 细胞 IFN- 分泌能力较 CD8+PD1+ T 细胞强，但与正常小鼠脾脏中 CD8+T 细
15、胞相比 IFN- 分泌能力亦明显下降（图 4C） 。A BA:CD8+PD1-T cell；B:CD8 +PD1+T cell；灰色空白为未染 CFSE（空白对照） ；灰色实心为 0 d 细胞尚未增殖（阳性对照） ；黑色空白为细胞在相应检测时间点的增殖状态图 3 CFSE 法检测肿瘤局部 CD8+PD1+T cell和 CD8+PD1-T cell的增殖A：肿瘤局部 CD8+PD1-细胞刺激后检测 IFN-；B：肿瘤局部 CD8+PD1+细胞刺激后检测 IFN-；C：肿瘤局部 CD8+PD1+、CD8 +PD1-两群细胞与正常小鼠脾脏中 CD8+PD1-T cell 经同样刺激后 IFN- 分
16、泌对比 图 4 CD8 +PD1+和 CD8+PD1-两群细胞功能应答分析3 讨论肿瘤严重危害人体健康，影响患者生活质量，已被列为头号致死性疾病。目前临床上主要采用手术及放化疗手段进行治疗，除良性肿瘤及部分早期恶性肿瘤可起到好的治疗效果外，晚期尤其是已伴发转移的恶性肿瘤尚无有效的治疗手段。研究发现，肿瘤患者常伴有免疫功能低下，表现为对肿瘤抗原无应答，无法有效清除体内肿瘤细胞。究竟何种免疫细胞在抗肿瘤过程中起到了关键作用，而其功能在肿瘤患者体内是否已发生变化，及如何增强其抗肿瘤活性已成为肿瘤研究中关注的重点。研究表明机体抗肿瘤过程中，CD8 +T 细胞发挥了关键作用。在急性感染过程中，初始 CD
17、8+T 细胞接受抗原刺激后，活化并大量扩增为效应 T 细胞，当抗原清除后，有一小部分效应 T 细胞分化成记忆性 T细胞 13-15。但是在慢性感染和肿瘤中，抗原特异性的 CD8+T 细胞由于受到抗原持久的刺激，不能有效分化成记忆性 T 细胞而逐步演变成功能紊乱的一群细胞 9, 15，称之为衰竭性 CD8+T 细胞。这群细胞表面持续性高表达 PD1 抑制性受体 16-17，另外还包括LAG-3，CD244，CD160，CTLA-4 和 Tim-317-19。它们共同调控着 CD8+T 细胞的衰竭。在慢性感染小鼠模型中，将 PD1 和 LAG-3/Tim-3 阻断后，可有效逆转CD8+T 细胞功能
18、紊乱恢复其功能活性 18-20。但肿瘤模型中，抑制性受体通路至今尚未研究清楚。本研究从 Lewis 肺癌移植模型中，成功分离出肿瘤浸润性 CD8+T 淋巴细胞，对衰竭性表型 PD1 分析发现 CD8+PD1+细胞的比例将近 80%，荷瘤小鼠脾脏中也占有较高的比例，然而在正常小鼠的脾脏中却几乎不存在。由此推测，肿瘤微环境可诱导免疫细胞表型发生改变，而这是否就是机体无法有效清除肿瘤致其长期定植的原因，为此我们检测了 CD8+PD1+ T 细胞的增殖活性和 IFN- 分泌功能，结果发现与CD8+PD1- T 细胞相比，其增殖活性和 IFN- 的分泌能力均明显下降。说明高表达 PD1+的肿瘤浸润性CD
19、8+T 淋巴细胞功能活性处于衰竭状态。在研究中我们还发现同样为 CD8+PD1-T 细胞，肿瘤局部与正常小鼠脾脏部位相比，其 IFN- 的分泌能力明显减低，推测肿瘤微环境可能影响免疫细胞功能的发挥。综上所述，本研究证实肿瘤局部存在浸润性PD1+CD8+T 淋巴细胞且其功能活性处于抑制状态，但具体调控机制尚不十分明确。目前许多研究表明微小 RNA（miR）调控着细胞生物学进程的关键环节，如：细胞代谢、增殖、分化、凋亡 21-22。免疫细胞功能的发挥和调节与 miR 同样密不可分 23。因此，我们将对 CD8+PD1+和 CD8+PD1-两群细胞的 miR 谱进行比较，从中找出具有显著性差异的功能
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