第四章 蛋白质范本.doc

1、祝大家 07 年生物考研取得优异成绩 学 子 272646652 21第四章 蛋白质 提要 一. 概念简单蛋白、 结合蛋白、基本氨基酸、等 电点、甲醛滴定法、Edman 降解、一 级结构、 肽键 、构型与构象、二面角、二级结构、超二级结构、结构域、三级结构、四级结构、亚基、别构蛋白、分子病、水化 层、双电层、蛋白 质的变性与复性、盐析与 盐溶二.氨基酸分类、基本氨基酸的 结构、分 类、名称、符号、化学反应、 鉴 定、蛋白质的水解三.蛋白质的结构一级结构 结构特点、 测定步骤、常用方法、酶二级结构 四种 结构特点、数据、超二级结构三级结构 主要靠疏水键维持四级结构 变构现象结构与功能的适应、结

2、构变化对功能的影响、典型蛋白质四.蛋白质的性质分子量的测定方法、酸碱性、溶解性、变性、颜色反应第一节 蛋白质通论一、蛋白质的功能多样性蛋白质是原生质的主要成分，任何生物都含有蛋白质。自然界中最小、最简单的生物是病毒，它是由蛋白质和核酸组成的。没有蛋白 质 也就没有生命。自然界的生物多种多样，因而蛋白质的种类和功能也十分繁多。概括起来，蛋白质主要有以下功能：1.催化功能 生物体内的 酶都是由蛋白质构成的，它们有机体新陈代谢的催化剂。没有酶，生物体内的各种化学反应就无法正常进行。例如，没有淀粉酶，淀粉就不能被分解利用。2.结构功能 蛋白 质可以作为生物体的结构成分。在高等动物里，胶原是主要的细胞外

3、 结构蛋白，参与结缔组织和骨骼作为身体的支架，占蛋白 总量的 1/4。细 胞里的片 层结构，如 细胞膜、线粒体、叶绿体和内质网等都是由不溶性蛋白与脂类组成的。动物的毛发和指甲都是由角蛋白构成的。3.运输功能 脊椎动物红细胞中的血红蛋白和无脊椎动物体内的血蓝蛋白在呼吸过程中起着运输氧气的作用。血液中的载脂蛋白可运 输脂肪， 转铁蛋白可转运铁。一些脂溶性激素的运 输也需要蛋白，如甲状腺素要与甲状腺素结合球蛋白结合才能在血液中运输。4.贮存功能 某些蛋白质的作用是贮存氨基酸作为生物体的养料和胚胎或幼儿生长发育的原料。此类蛋白质包括蛋类中的卵清蛋白、奶 类中的酪蛋白和小麦种子中的麦醇溶蛋白等。肝脏 中

4、的铁蛋白可将血液中多余的铁储存起来，供缺 铁时 使用。5.运动功能 肌肉中的肌球蛋白和肌动蛋白是运动系统的必要成分，它 们构象的改变 引起肌肉的收缩，带动机体运动。细 菌中的鞭毛蛋白有 类似的作用，它的收缩引起鞭毛的摆动，从而使细菌在水中游动。6.防御功能 高等动物的免疫反应是机体的一种防御机能，它主要也是通过蛋白质（抗体）来 实现的。凝血与纤溶系统的蛋白因子、溶菌 酶、干 扰素等，也担负着防御和保护功能。7.调节功能 某些激素、一切激素受体和许多其他调节因子都是蛋白质。8.信息传递功能 生物体内的信息传递过程也离不开蛋白质。例如，视觉信息的传递要有视紫红质参与，感受味道需要味觉蛋白。 视杆

5、细胞中的视紫红质，只需 1 个光子即可被激 发， 产 生视觉。9.遗传调控功能 遗传信息的储存和表达都与蛋白质有关。 DNA 在储存时是缠绕在蛋白质（组蛋白）上的。有些蛋白质 ，如阻遏蛋白，与特定基因的表达有关。半乳糖苷酶基因的表达受到一种阻遏蛋白的抑制，当需要合成 半乳糖苷酶时经过去阻遏作用才能表达。10.其他功能 某些生物能合成有毒的蛋白质，用以攻击或自卫。如某些植物在被昆虫咬 过以后会产生一种毒蛋白。白喉毒素可抑制生物蛋白质合成。二、蛋白质的分类（一）按分子形状分类1.球状蛋白 外形近似球体，多溶于水，大都具有活性，如酶 、转运蛋白、蛋白激素、抗体等。球状蛋白的长度与直径之比一般小于 1

6、0。2.纤维状蛋白 外形细长，分子量大，大都是结构蛋白，如胶原蛋白，弹性蛋白，角蛋白等。纤维蛋白按溶解性可分为可溶性纤维蛋白与不溶性纤维蛋白。前者如血液中的纤维蛋白原、肌肉中的肌球蛋白等，后者如胶原蛋白，弹性蛋白，角蛋白等结构蛋白。（二）按分子组成分类1.简单蛋白 完全由氨基酸组成，不含非蛋白成分。如血清清蛋白等。根据溶解性的不同，可将简单蛋白分为以下 7 类：清蛋白、球蛋白、组蛋白、精蛋白、祝大家 07 年生物考研取得优异成绩 学 子 272646652 22谷蛋白、醇溶蛋白和硬蛋白。2.结合蛋白 由蛋白 质和非蛋白成分组成，后者称为辅基。根据辅基的不同，可将结 合蛋白分为以下7 类：核蛋

7、白、脂蛋白、糖蛋白、磷蛋白、血红素蛋白、黄素蛋白和金属蛋白。三、蛋白质的元素组成与分子量1.元素组成 所有的蛋白质都含有碳氢氧氮四种元素，有些蛋白质还 含有硫、磷和一些金属元素。蛋白质平均含碳 50，氢 7，氧 23，氮 16。其中氮的含量较为恒定，而且在糖和脂 类中不含氮，所以常通过测量样品中氮的含量来测定蛋白质含量。如常用的凯氏定氮：蛋白质含量蛋白氮6.25其中 6.25 是 16的倒数。2.蛋白质的分子量 蛋白质的分子量变化范围很大，从 6000 到 100 万或更大。 这个范围 是人为规定的。一般将分子量小于 6000 的称为肽。不过这个界限不是绝对的，如牛胰 岛素分子量为 5700，

8、一般仍 认为是蛋白质。蛋白质煮沸凝固，而肽不凝固。较大的蛋白质如烟草花叶病毒，分子量达 4000 万。四、蛋白质的水解氨基酸是蛋白质的基本结构单位，这个发现是从蛋白质的水解得到的。蛋白质的水解主要有三种方法：1.酸水解 用 6MHCl 或 4MH2SO4，105回流 20小时即可完全水解。酸水解不引起氨基酸的消旋，但色氨酸完全被破坏，丝氨酸和苏 氨酸部分破坏，天冬酰胺和谷氨酰胺的酰胺基被水解。如样品含有杂质，在酸水解过 程中常产生腐黑 质，使水解液 变黑。用 3mol/L 对甲苯磺酸代替盐酸，得到色氨酸较多，可像丝氨酸和 苏氨酸一样用外推法求其含量。2.碱水解 用 5MNaOH，水解 1020

9、 小时可水解完全。碱水解使氨基酸消旋，许多氨基酸被破坏，但色氨酸不被破坏。常用于测定色氨酸含量。可加入淀粉以防止氧化。3.酶水解 酶水解既不破坏氨基酸，也不引起消旋。但酶水解时间长，反应不完全。一般用于部分水解，若要完全水解，需要用多种酶协同作用。第二节 氨基酸 一、氨基酸的结构与分类（一）基本氨基酸组成蛋白质的 20 种氨基酸称为基本氨基酸。它们中除脯氨酸外都是 -氨基酸，即在 -碳原子上有一个氨基。基本氨基酸都符合通式，都有单字母和三字母缩写符号。按照氨基酸的侧链结构，可分 为三 类：脂肪族氨基酸、芳香族氨基酸和杂环氨基酸。1.脂肪族氨基酸 共 15 种。侧链只是烃链：Gly, Ala,

10、Val, Leu, Ile 后三种带有支链，人体不能合成，是必需氨基酸。侧链含有羟基：Ser, Thr 许多蛋白酶的活性中心含有丝氨酸，它还在蛋白 质与糖类及磷酸的 结合中起重要作用。侧链含硫原子：Cys, Met 两个半胱氨酸可通过形成二硫键结合成一个胱氨酸。二硫键对维 持蛋白质的高级结构有重要意义。半胱氨酸也经常出现在蛋白质的活性中心里。甲硫氨酸的硫原子有时参与形成配位键。甲硫氨酸可作 为通用甲基供体，参与多种分子的甲基化反应。侧链含有羧基：Asp（D）, Glu（E）侧链含酰胺基：Asn（N）, Gln（Q）侧链显碱性：Arg（R）, Lys（K）2.芳香族氨基酸 包括苯丙氨酸（ Phe

11、,F）和酪氨酸(Tyr,Y)两种。 酪氨酸是合成甲状腺素的原料。3.杂环氨基酸 包括色氨酸(Trp,W)、组氨酸(His)和脯氨酸(Pro)三种。其中的色氨酸与芳香族氨基酸都含苯环，都有紫外吸收 (280nm)。所以可通过测量蛋白质的紫外吸收来测定蛋白质的含量。组氨酸也是碱性氨基酸，但碱性较弱，在生理条件下是否带电与周围内环境有关。它在活性中心常起 传递电荷的作用。组 氨酸能与 铁等金属离子配位。脯氨酸是唯一的仲氨基酸，是 -螺旋的破坏者。B 是指 Asx，即 Asp 或 Asn；Z 是指 Glx，即 Glu 或Gln。基本氨基酸也可按侧链极性分类：非极性氨基酸：Ala, Val, Leu,

12、Ile, Met, Phe, Trp, Pro共八种极性不带电荷：Gly, Ser, Thr, Cys, Asn, Gln, Tyr 共七种带正电荷：Arg, Lys, His带负电荷：Asp, Glu（二）不常见的蛋白质氨基酸某些蛋白质中含有一些不常见的氨基酸，它们是基本氨基酸在蛋白质合成以后经羟化、羧化、甲基化等修饰衍生而来的。也叫稀有氨基酸或特殊氨基酸。如 4-羟脯氨酸、5-羟赖氨酸、锁链素等。其中羟脯氨酸和羟赖氨酸在胶原和弹性蛋白中含量较多。在甲状腺素中还有 3,5-二碘酪氨酸。祝大家 07 年生物考研取得优异成绩 学 子 272646652 23（三）非蛋白质氨基酸自然界中还有 1

13、50 多种不参与构成蛋白质的氨基酸。它们 大多是基本氨基酸的衍生物，也有一些是D-氨基酸或 、-氨基酸。这些氨基酸中有些是重要的代谢物前体或中间产物，如瓜氨酸和鸟氨酸是合成精氨酸的中间产物，- 丙氨酸是遍多酸（泛酸，辅酶 A 前体）的前体，-氨基丁酸是 传递神经冲动的化学介质。二、氨基酸的性质（一）物理性质-氨基酸都是白色晶体，每种氨基酸都有特殊的 结晶形状，可以用来鉴别各种氨基酸。除胱氨酸和酪氨酸外，都能溶于水中。脯氨酸和羟脯氨酸还能溶于乙醇或乙醚中。除甘氨酸外，- 氨基酸都有旋光性，-碳原子具有手性。苏 氨酸和异亮氨酸有两个手性碳原子。从蛋白质水解得到的氨基酸都是 L-型。但在生物体内特别

14、是细菌中， D-氨基酸也存在，如 细菌的细胞壁和某些抗菌素中都含有 D-氨基酸。三个带苯环的氨基酸有紫外吸收， F:257nm,=200; Y:275nm,=1400; W:280nm,=5600。通常蛋白 质的紫外吸收主要是后两个氨基酸决定的，一般在280nm。氨基酸分子中既含有氨基又含有羧基，在水溶液中以偶极离子的形式存在。所以氨基酸晶体是离子晶体，熔点在 200以上。氨基酸是两性 电解质，各个解离基的表观解离常数按其酸性强度递降的顺序，分别以 K1、K2来表示。当氨基酸分子所带的净电荷为零时的 pH 称为氨基酸的等电点(pI)。等电点的值是它在等电点前后的两个 pK值 的算术平均值。氨基

15、酸完全质子化时可看作多元弱酸，各解离基 团的表观解离常数按酸性减弱的顺序，以 pK1 、pK2 、pK3表示。氨基酸可作为缓冲溶液，在pK处的缓冲能力最强，pI 处的缓 冲能力最弱。氨基酸的滴定曲线如图。（二）化学性质1.氨基的反应（1）酰化氨基可与酰化试剂，如酰氯或酸酐 在碱性溶液中反应，生成 酰胺。 该 反应在多肽合成中可用于保 护氨基。（2）与亚硝酸作用氨基酸在室温下与亚硝酸反应，脱氨，生成羟基羧酸和氮气。因为伯胺都有 这个反应 ，所以 赖氨酸的侧链氨基也能反应，但速度 较慢。常用于蛋白质的化学修饰、水解程度 测定及氨基酸的定量。（3）与醛反应氨基酸的 -氨基能与 醛类物质反应，生成西佛

16、碱 -C=N-。西佛碱是氨基酸作为底物的某些酶促反应的中间物。赖氨酸的 侧链氨基也能反 应。氨基 还可以与甲醛反应，生成羟甲基化合物。由于氨基酸在溶液中以偶极离子形式存在，所以不能用酸碱滴定测定含量。与甲醛 反应后，氨基酸不再是偶极离子，其滴定终点可用一般的酸碱指示剂指示，因而可以滴定，这 叫甲醛滴定法，可用于测 定氨基酸。（4）与异硫氰酸苯酯(PITC)反应-氨基与 PITC 在弱碱性条件下形成相应的苯氨基硫甲酰衍生物（PTC-AA），后者在硝基甲烷中与酸作用发生环化，生成相 应的苯乙内 酰硫脲衍生物（PTH-AA）。这些衍生物是无色的，可用层析法加以分离鉴定。这个反 应首先为 Edman

17、用来鉴定蛋白质的 N-末端氨基酸，在蛋白质的氨基酸顺序分析方面占有重要地位。（5）磺酰化氨基酸与 5-(二甲胺基) 萘-1-磺酰氯(DNS-Cl) 反应，生成 DNS-氨基酸。产物在酸性条件下(6NHCl)100也不破坏，因此可用于氨基酸末端分析。DNS-氨基酸有强荧光，激发波长在 360nm 左右，比较灵敏，可用于微量分析。（6）与 DNFB 反应氨基酸与 2,4-二硝基氟苯(DNFB)在弱碱性溶液中作用生成二硝基苯基氨基酸（DNP 氨基酸）。这一反应是定量转变的，产物黄色，可经受酸性 100高温。该 反应曾被英国的 Sanger 用来测定胰岛素的氨基酸顺序，也叫桑格 尔试剂，现在应用于蛋白

18、质 N-末端测定。（7）转氨反应在转氨酶的催化下，氨基酸可脱去氨基，变成相应的酮酸。2.羧基的反应羧基可与碱作用生成盐，其中重金属盐不溶于水。羧基可与醇生成酯，此反应常用于多 肽合成中的羧基保护。某些 酯有活化作用，可增加羧基活性，如对硝基苯酯。将氨基保 护以后，可与二氯亚砜或五氯化磷作用生成酰氯，在多肽合成中用于活化 羧基。在脱羧酶的催化下，可脱去羧基，形成伯胺。3 茚三酮反应氨基酸与茚三酮在微酸性溶液中加热，最后生成蓝祝大家 07 年生物考研取得优异成绩 学 子 272646652 24色物质。而脯氨酸生成黄色化合物。根据这个反应可通过二氧化碳测定氨基酸含量。4.侧链的反应丝氨酸、 苏氨

19、酸含 羟基，能形成 酯 或苷。半胱氨酸侧链巯基反应性高：（1）二硫键(disulfide bond)半胱氨酸在碱性溶液中容易被氧化形成二硫键，生成胱氨酸。胱氨酸中的二硫键在形成蛋白 质的构象上起很大的作用。氧化剂和还原剂 都可以打开二硫键。在研究蛋白质结 构时，氧化 剂过 甲酸可以定量地拆开二硫键，生成相 应的磺酸。还原剂如巯基乙醇、巯 基乙酸也能拆开二硫键，生成相应的巯基化合物。由于半胱氨酸中的巯基很不 稳定，极易氧化，因此利用还原剂拆开二硫键时，往往进一步用碘乙酰胺、 氯 化苄、 N-乙基丁烯二亚酰 胺和对氯汞苯甲酸等试剂与巯基作用，把它保 护起来，防止它重新氧化。（2）烷化半胱氨酸可与烷

20、基试剂，如碘乙酸、碘乙酰胺等发生烷化反应。半胱氨酸与丫丙啶反应，生成带正 电的侧链，称 为S-氨乙基半胱氨酸（AECys）。（3）与重金属反应极微量的某些重金属离子，如 Ag+、Hg2+，就能与巯基反应，生成硫醇 盐， 导致含巯 基的酶失活。5. 以下反应常用于氨基酸的检验：l 酪氨酸、组氨酸能与重氮化合物反应(Pauly 反应)，可用于定性、定量 测定。 组氨酸生成棕红色的化合物，酪氨酸为 桔黄色。l 精氨酸在氢氧化钠中与 1-萘酚和次溴酸 钠反应，生成深红色，称 为 坂口反应。用于胍基的鉴定。l 酪氨酸与硝酸、 亚硝酸、硝酸汞和亚硝酸汞反应，生成白色沉淀，加热后变红，称 为 米伦反应，是鉴

21、定酚基的特性反应。l 色氨酸中加入乙 醛酸后再缓慢加入浓硫酸，在界面会出现紫色环，用于鉴定吲哚 基。在蛋白质中，有些 侧链基团被包裹在蛋白 质内部，因而反应很慢甚至不反应。三、色谱与氨基酸的分析分离1.色谱（chromatography ）的发展史最早的层析实验是俄国植物学家 在 1903 年用碳酸钙分离叶绿素，属于吸附 层 析。 40 年代出现了分配层析，50 年代出 现了气相色 谱， 60 年代出现 HPLC，80 年代出 现了超临界层析，90 年代出现的超微量 HPLC 可分离 ng 级的样品。2.色谱的分类：按流动相可分为气相、液相、超临界色谱等；按介质可分为纸层析、薄层层析、柱层析等

22、；按分离机制可分为吸附层析、分配层析、分子 筛层析等3.色谱的应用可用于分离、制备 、纯度鉴定等。定性可通过保留值、内标、 标准曲 线等方法，定量一般用标准曲线法。氨基酸的分析分离是测定蛋白质结构的基础。在分配层析和离子交换层析法开始应用于氨基酸成分分析之后，蛋白质结 构的研究才取得了 显著的成就。现在这些方法已自动化。氨基酸从强酸型离子交换柱的洗脱顺序如下：Asp,Thr,Ser,Glu,Pro,Gly,Ala,Cys,Val,Met,Ile,Leu,Tyr,Phe,Lys,His,(NH3),Arg 第三节 蛋白质的一级结构 蛋白质是生物大分子，具有明显 的结构层次性，由低层到高层可分为一

23、级结构、二级结构、三 级结构和四级结构。一、肽键和肽一个氨基酸的羧基与另一个氨基酸的氨基缩水形成的共价键，称为肽键 。在蛋白 质 分子中，氨基酸借肽键连接起来，形成 肽链。最简单的肽由两个氨基酸组成，称为二肽。含有三、四、五个氨基酸的肽分别称为三肽 、四 肽、五肽等。肽链中的氨基酸由于形成肽键时脱水，已不是完整的氨基酸，所以称为残基。 肽的命名是根据 组成肽的氨基酸残基来确定的。一般从肽 的氨基端开始，称为某氨基酰某氨基酰某氨基酸。肽的书写也是从氨基端开始。肽键象酰胺键一样，由于键内原子 处于共振状态而表现出较高的稳定性。在 肽键中 CN 单键具有约40双键性质，而 C=O 双键具有 40单键

24、性质。这样就产生两个重要结果：（1）肽键的亚氨基在 pH 0-14 的范围内没有明显的解离和质 子化的倾向；（2）肽键中的 CN 单键不能自由旋 转，使蛋白 质能折叠成各种三维构象。除了蛋白质部分水解可以产生各种简单的多肽以外，自然界中还有 长短不等的小肽 ，它 们具有特殊的生理功能。动植物细胞中含有一种三肽，称为 谷胱甘肽，即 -谷氨酰半胱氨酰甘氨酸。因其含有 巯基，故常以祝大家 07 年生物考研取得优异成绩 学 子 272646652 25GSH 来表示。它在体内的氧化 还原过程中起重要作用。脑 啡肽是天然止痛 剂。肌肉中的鹅肌肽是一个二肽，即 -丙氨酰组氨酸。肌肽可作为肌肉中的缓冲剂，

25、缓冲肌肉 产生的乳酸对 pH 的影响。一种抗菌素叫做短杆菌酪肽，由 12 种氨基酸 组成，其中有几种是 D-氨基酸。这些天然肽中的非蛋白质氨基酸可以使其免遭蛋白酶水解。许 多激素也是多肽，如催产素、加 压素、舒缓激肽等。二、肽的理化性质小肽的理化性质与氨基酸类似。许 多小肽已经结晶。晶体的熔点很高，说明是离子晶体，在水溶液中以偶极离子存在。肽键 的亚氨基不解离，所以肽的酸碱性取决于肽的末端氨基、 羧基和 侧链上的基团。在长肽或蛋白质中，可解离的基 团 主要是侧链上的。肽中末端羧基的 pK比自由氨基酸的稍大，而末端氨基的 pK则稍小。侧链基团变化不大。肽的滴定曲线和氨基酸的很相似。 肽的等电点也

26、可以根据它的 pK值确定。一般小肽的旋光度等于各个氨基酸旋光度的总和，但较大的肽或蛋白质的旋光度不等于其组成氨基酸的旋光度的简单加和。肽的化学性质和氨基酸一样，但有一些特殊的反 应，如双缩脲反应。一般含有两个或两个以上 肽键的化合物都能与 CuSO4 碱性溶液发生双缩脲反应而生成紫红色或蓝紫色的复合物。利用 这个反应可以测定蛋白质的含量。三、一级结构的测定（一）一级结构蛋白质的一级结构是指肽链的氨基酸组成及其排列顺序。氨基酸序列是蛋白质分子 结构的基础，它决定蛋白质的高级结构。一级结构可用氨基酸的三字母符号或单字母符号表示，从 N-末端向 C-末端书写。采用三字母符号时，氨基酸之间用连字符（）

27、隔开。（二）测定步骤测定蛋白质的一级结构，要求 样品必 须是均一的（纯度大于 97）而且是已知分子量的蛋白质。一般的测定步骤是：1.通过末端分析确定蛋白质分子由几条肽链构成。2.将每条肽链分开，并分离提 纯。3.肽链的一部分样品进行完全水解，测定其氨基酸组成和比例。4.肽链的另一部分样品进行 N 末端和 C 末端的鉴定。5.拆开肽链内部的二硫键。6. 肽链用酶促或化学的部分水解方法降解成一套大小不等的肽段，并将各个 肽段分离出来。7.测定每个肽段的氨基酸顺序。8.从第二步得到的肽链样品再用另一种部分水解方法水解成另一套肽段，其断裂点与第五步不同。分离肽段并测序。比较两套肽段的氨基酸 顺序，根据

28、其重叠部分拼凑出整个肽链的氨基酸顺序。9. 测定原来的多肽链中二硫键和酰胺基的位置。（三）常用方法1. 末端分析（1）N 末端蛋白质的末端氨基与 2,4-二硝基氟苯 (DNFB)在弱碱性溶液中作用生成二硝基苯基蛋白质（DNP-蛋白质）。 产物黄色，可经受酸性 100高温。水解时， 肽链断开，但 DNP 基并不脱落。 DNP-氨基酸能溶于有机溶剂（如乙醚）中，这样可与其他氨基酸和 -DNP 赖氨酸分开。再经双向滤纸层析或柱层析，可以鉴定黄色的 DNP 氨基酸。丹磺酰氯法是更灵敏的方法。蛋白 质的末端氨基与 5-(二甲胺基)萘-1-磺酰氯(DNS-Cl) 反应，生成DNS-蛋白质。DNS- 氨基酸

29、有强荧光，激 发波长在360nm 左右，比 DNFB 法灵敏 100 倍。目前应用最广泛的是异硫氰酸苯酯(PITC)法。末端氨基与 PITC 在弱碱性条件下形成相 应的苯氨基硫甲酰衍生物，后者在硝基甲烷中与酸作用 发生环化，生成相应的苯乙内酰硫脲衍生物而从肽链上掉下来。产 物可用气 -液色谱法进行鉴定。这个方法最大的优点是剩下的肽链仍是完整的，可依照此法重复测定新生的 N 末端氨基酸。 现在已 经有全自动的氨基酸顺序分析仪，可测定含 20 个以上氨基酸的 肽段的氨基酸顺序。缺点是不如丹磺 酰氯灵敏，可与之结合使用。N 末端氨基酸也可用酶学方法即氨肽酶法测定。（2）C 末端a) C 末端氨基酸可

30、用硼氢化锂还原生成相应的 氨基醇。肽链水解后，再用层析法 鉴定。有断裂干扰。b)另一个方法是肼解法。多肽与肼在无水条件下加热，可以断裂所有的肽键，除 C 末端氨基酸外，其他氨基酸都转变为相应的酰肼化合物。肼解下来的 C 末端氨基酸可用纸层析鉴定。精氨酸会变成鸟祝大家 07 年生物考研取得优异成绩 学 子 272646652 26氨酸，半胱氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺被破坏。c) 也可用羧肽酶 法鉴定。将蛋白 质 在 pH 8.0, 30与羧肽酶一起保温，按一定时间间 隔取样，用 纸层析测定释放出来的氨基酸，根据氨基酸的量与时间的关系，就可以知道 C 末端氨基酸的排列 顺序。羧肽酶 A 水解除精氨

31、酸、 赖氨酸和脯氨酸外所有 肽键，羧肽酶 B 水解精氨酸和赖氨酸。2.二硫键的拆开和肽链的分离一般情况下，蛋白质分子中肽链的数目 应等于 N 末端氨基酸残基的数目，可根据末端分析来确定一种蛋白质由几条肽链构成。必 须设法把 这些肽链分离开来，然后测定每条 肽链的氨基酸 顺序。如果 这些肽链之间不是共价交联的，可用酸、碱、高浓度的盐或其他变性剂处理蛋白质，把肽链 分开。如果 肽链之间以二硫键交联，或肽链中含有 链内二硫键，则必须用氧化或还原的方法将二硫键拆开。最普遍的方法是用过量的巯基乙醇处理，然后用碘乙酸保护生成的半胱氨酸的巯基，防止重新氧化。二硫键拆开后形成的个别肽链，可用纸层 析、离子交

32、换柱层析、 电 泳等方法 进行分离。3.肽链的完全水解和氨基酸组成的测定。在测定氨基酸顺序之前，需要知道多 肽链的氨基酸组成和比例。一般用酸水解，得到氨基酸混合物，再分离测定氨基酸。目前用氨基酸自 动分析仪，24 小时即可完成。蛋白质的氨基酸组成，一般用每分子蛋白 质中所含的氨基酸分子数表示。不同种类的蛋白 质，其氨基酸组成相差很大。4.肽链的部分水解和肽段的分离当肽链的氨基酸组成及 N 末端和 C 末端已知后，随后的步骤是肽链的部分水解。 这 是测序工作的关键步骤。这一步通常用 专一性很强 的蛋白酶来完成。最常用的是胰蛋白酶（trypsin），它专门水解赖氨酸和精氨酸的羧基形成的肽键，所以生

33、成的肽段之一的 C 末端是赖氨酸或精氨酸。用丫丙啶处理，可增加酶切位点（半胱氨酸）；用马来酸酐（顺丁烯二酸酐）保护赖氨酸的侧链氨基，或用 1,2-环己二酮修饰精氨酸的胍基，可减少酶切位点。经常使用的还有糜蛋白酶，水解苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸等疏水残基的羧基形成的肽键。其他疏水残基反应较慢。用溴化氰处理，可断裂甲硫氨酸的 羧基形成的肽键。水解后甲硫氨酸残基转变为 C 末端高 丝氨酸残基。以上三种方法经常使用。胃蛋白酶和嗜热菌蛋白酶。前者水解疏水残基之 间的肽键，后者水解疏水残基的氨基形成的肽键。金葡菌蛋白酶，又称谷氨酸蛋白酶 或 V8 蛋白酶，水解谷氨酸和天冬氨酸的羧基形成的肽键，但受缓冲液影响

34、。在醋酸缓冲液中只水解谷氨酸，在磷酸缓冲液中还可水解天冬氨酸。梭状芽孢杆菌蛋白酶，水解精氨酸羧基形成的肽键，又称精氨酸蛋白酶。耐变性剂，可经受 6M 尿素 2小时。可用于水解不易溶解的蛋白。凝血酶，水解 Arg-Gly 肽键。羟胺可水解 Asn-Gly，但 Asn-Leu 和 Asn-Ala 也能部分裂解。以上方法中，酶不能水解脯氨酸参与形成的肽键。多肽部分水解后，降解成长短不一的小 肽段，可用层析或电泳加以分离提纯。经常用双向 层析或电泳分离，再用茚三酮显 色，所得的 图谱 称为肽指纹谱。5.多肽链中氨基酸顺序的测定从多肽链中部分水解得到的肽段可用化学法或酶法测序，然后比较 用不同方法获得的

35、两套 肽段的氨基酸顺序，根据它 们彼此重叠的部分，确定每个肽段的适当位置，拼凑出整个多肽链 的氨基酸顺序。6.二硫键位置的确定一般用蛋白酶水解带有二硫键的蛋白质，从部分水解产物中分离出含二硫键的肽段，再拆开二硫键，将两个肽段分别测序，再与整个多肽链比较，即可确定二硫键的位置。常用胃蛋白酶 ，因其 专一性低，生成的肽段小，容易分离和鉴定，而且可在酸性条件下作用（pH2），此时二硫键稳定。肽段的分离可用对角线电泳，将混合物点到滤纸 的中央，在pH6.5 进行第一次电泳，然后用 过 甲酸蒸汽断裂二硫键，使含二硫键 的肽段变成一对 含半胱氨磺酸的肽段。将 滤纸旋转 90 度后在相同条件下 进行第二次电

36、泳，多数肽段迁移率不 变， 处 于对角线上，而含半胱氨磺酸的肽段因负电荷增加而偏离对角线。用茚三酮显色，分离，测序，与多 肽链比较，即可确定二硫键位置。四、多肽合成多肽的人工合成有两种类型，一种是由不同氨基酸按照一定顺序排列的控制合成，另一种是由一种或两种氨基酸聚合或共聚合。控制合成的一个困难是进行接肽反应所需的试剂，能同时 和其他官能团反应。因此在接肽以前必 须首先将这 些基团加以封闭祝大家 07 年生物考研取得优异成绩 学 子 272646652 27或保护，肽键形成后再除去保 护基。这样每连接一个氨基酸残基都要经过几个步骤，要得到较长的肽链就必须每步都有较高的产率。如果每一步反 应产率

37、都是 90%，那么 30 次反应后总产率只有 4.24%。保护基必须在接肽时起保护作用，在接肽后容易除去，又不引起肽键 断裂。最常用的氨基保护基 Y 是苄氧甲酰基，可用催化加 氢或用金属 钠在液氨中处理除去。其他还有三苯甲基、叔丁氧甲酰基等，可用稀盐酸或乙酸在室温下除去。羧基保护基 Z 通常用烷基，如乙基，可在室温下皂化除去。如用苄基，可用催化加氢 除去。肽键不能自发形成，常用 缩合剂促 进肽键形成。接肽用的缩合剂最有效的是 N,N-二环己基碳二亚胺(DC CI)。DCCI 从两个氨基酸分子中夺取一分子水，自身变为不溶的 N,N-二环己基脲，从反应液中沉淀出来，可过滤除去。接肽反应除用 缩合剂

38、以外，还可用分别活化参加形成肽键的羧基和氨基的方法。羧 基活化可用叠氮化物法和活化酯法（对硝基苯酯）等；氨基活化一般不需特殊手段，通常在接肽时加入有机碱，如三乙胺，保证氨基在自由状态即可。近年来固相多肽合成迅速发展。在固相合成中，肽链的逐步延长是在不溶的聚苯乙烯树脂小圆珠上进行的。合成多肽 的羧基端先和氯 甲基聚苯乙烯树脂反应，形成 苄酯 。第二个氨基酸的氨基用叔丁氧甲酰基保护后，以 DCCI 为缩合剂，接在第一个氨基酸的氨基上。重复这个方法，可使肽链按一定顺序延长。最后把树 脂悬浮在无水三氟乙酸中，通入干燥 HBr，使多 肽 与树脂分离，同时除去保护基。整个合成过程现在已经可以在自动化固相多

39、肽合成仪上进行。平均合成每个肽键只需三小 时。此法可用于医药工业。人工合成的催 产 素没有混杂的加压素，比提取的天然药品好。已 经 成功合成含 124个残基的蛋白。第四节 蛋白质的高级结构 蛋白质的多肽链并不是线形伸展的，而是按一定方式折叠盘绕成特有的空间结构。蛋白质的三维构象，也称空间结构或高 级结构，是指蛋白质分子中原子和基团在三维空间上的排列、分布及 肽链的走向。高级结 构是蛋白 质表现其生物功能或活性所必须的，包括二级、三级和四级结构。Primary structure, secondary, tertiary, quaternary structure一、有关概念1. 构型 conf

40、igration 与构象 conformation构型指立体异构体中取代原子或基团在空间的取向，构型的改变必 须通过共价键的断裂。构象是指这些取代基团当单键旋转时可能形成的不同的立体结构，构象的改 变不涉及共价键 的改变。2. 二面角因为肽键不能自由旋转，所以肽键 的四个原子和与之相连的两个 碳原子共处一个平面，称肽平面。肽平面内的 C=O 与 NH 呈反式排列，各原子间的键长和键角都是固定的。 肽链可看作由一系列 刚性的肽平面通过 碳原子连接起来的长链，主链的构象就是由肽平面之间的角度决定的。主 链上只有 碳原子连接的两个键是单键，可自由旋转。绕CN1 旋转的角称 ，而 绕 CC2 旋转的角

41、称。这两个角称为 二面角。 规定当旋转键两侧的肽链成顺式时为 0 度。取值范围是正 负 180 度，当二面角都是 180 度时肽链完全伸展。由于空 间位阻，实际的取值范围是很有限的。二、二级结构（一）二级结构是肽链的空间走向蛋白质的二级结构是指肽链主链的空间走向（折叠和盘绕方式），是有 规则重复的构象。肽链主链具有重复结构，其中氨基是 氢键供体，羰基是氢键受体。通过形成链内或链间氢键可以使肽链卷曲折叠形成各种二级结构单元。复杂的蛋白 质分子结构，就由这些比较简单的二级结构单元进一步组合而成。（二）肽链卷曲折叠形成四种二级结构单元1.螺旋(-helix) 螺旋模型是 Pauling 和 Core

42、y 等研究 -角蛋白 时于 1951 年提出的。角蛋白是动物的不溶性纤维状蛋白，是由 动物的表皮衍生而来的。它包括皮肤的表皮以及毛发、鳞、羽、甲、蹄、角、丝等。角蛋白可分 为两类，一 类是 角蛋白，胱氨酸含量丰富，如角、甲、蹄的蛋白胱氨酸含量高达22；另一类是 角蛋白，不含胱氨酸，但甘氨酸、丙氨酸和丝氨酸的含量很高，蚕丝丝 心蛋白就属于这一类。 角蛋白，如 头发，暴露于湿热环境中几乎可以伸长一倍，冷却干燥后又收缩 到原来长度。 角蛋白则无此变化。角蛋白的 X 射线衍射图案极其相似，沿长轴方向都有一个大周期结构或重复单位，其长度为 55.5埃。Pauling 等考虑到肽平面对多肽链构象的限制作用

43、，设计 了多肽链 折叠的各种可能模型，发现其中一种 螺旋模型能很好地说明 角蛋白的 X 射线衍射图案中的 55.5 埃重复单位。在这个模型中，每隔 3.6 个氨基酸残基螺旋上升一圈，相当于祝大家 07 年生物考研取得优异成绩 学 子 272646652 28向上平移 5.4 埃。螺旋的直径是 11 埃。螺旋上升 时，每个氨基酸残基沿轴旋转 100，向上平移 1.5 埃，比完全伸展的构象压缩 2.4 倍。这 与衍射图案中的小周期完全一致。其二面角 =-57度， =-48度。在 螺旋中氨基酸残基的侧链伸向外侧，相邻的螺圈之间形成链内氢键，氢键的取向几乎与中心 轴平行。氢键是由肽键 中氮原子上的氢

44、 与其 N 端第四个羰基上的氧之间形成的。 螺旋的结构允许所有的肽键都参与链内氢键的形成，因此相当 稳定。 -螺旋由氢键构成一个封闭环，其中包括三个残基，共13 个原子，称为 3.613（n=3）螺旋。由 L 型氨基酸构成的多肽链可以卷曲成右手螺旋，也可卷曲成左手螺旋，但右手螺旋比较稳定。因 为在左手螺旋中 碳与 羰基过于接近，不稳定。在天然蛋白质中，几乎所有 螺旋都是右手螺旋。只在嗜热菌蛋白酶中发现一圈左手螺旋。在 角蛋白中，3 或 7 个 螺旋可以互相拧在一起，形成三股或七股的螺旋索，彼此以二硫键交联在一起。 螺旋不仅是 角蛋白的主要构象，在其他纤维蛋白和球状蛋白中也广泛存在，是一种常见的

45、二 级结构。螺旋是一种不对称的分子结构，具有旋光能力。螺旋的比旋不等于其中氨基酸比旋的简单加和，因为它的旋光性是各个氨基酸的不对称因素和构象本身不对称因素的总反映。天然 螺旋的不对称因素引起偏振面向右旋转。利用 螺旋的旋光性，可以测定它的相对含量。一条肽链能否形成 螺旋，以及螺旋的 稳定性怎样，与其一级结构有极大关系。脯氨酸由于其 亚氨基少一个氢原子，无法形成 氢键，而且 CN 键不能旋转，所以是 螺旋的破坏者， 肽链中出现脯氨酸就中断 螺旋，形成一个“ 结节”。此外，侧链带电荷及侧链基团过大的氨基酸不易形成 螺旋，甘氨酸由于侧链太小，构象不 稳定，也是 螺旋的破坏者。根据各种残基的特性，可以

46、预测蛋白 质的二级结构。目前常见的预测方法有 Chou-Fasman 法、GOR 法、Lim 法等，都是根据统计信息进行预测的。如果二级结构的预测成功率大于 80，就可以用来预测高级结构，但目前只能达到 70左右。Chou-Fasman 法比较直观，与二级结构形成的实际过程接近，但成功率不高。Chou-Fasman 法根据各个氨基酸在一些已知结构的蛋白质中的表现，按构象参数 P(表示形成 螺旋的能力) 由大到小将他们分为六组 ，依次为：最强的形成者(H)：Glu、Met、 Ala、Leu中等的形成者(h)：Lys、Phe、 Gln、Trp、Ile、Val很弱的形成者(I)：Asp、His中立者

47、(i)：Cys、Ser、Thr、Arg较弱的破坏者(b)：Asn、 Tyr最强的破坏者(B)：Gly、 Pro如肽链中 6 个连续的残基中有 4 个 h即可形成核心，然后向两侧延伸，遇到四肽破坏者 时中止。形成 螺旋时有协同性，即一旦形成核心，其它残基就容易加入。2.-折叠（-pleated sheet） -折叠也叫 -片层，在 -角蛋白如蚕丝丝心蛋白中含量丰富。其 X 射线衍射图案与 -角蛋白拉伸后的 图案很相似。在此结构中，肽链较为伸展，若干条 肽链或一条 肽链的若干肽段平行排列，相邻主 链骨架之间靠氢键维 系。 氢键与链的长轴接近垂直。 为形成最多的 氢键，避免相 邻侧链间的空间障碍，锯

48、齿状的主链 骨架必须作一定的折叠(=139,=135)，以形成一个折叠的片层。侧链交替位于片 层的上方和下方，与片层垂直。折叠有两种类型，一种是平行式，即所有肽链的氨基端在同一端；另一种是反平行式，即所有肽链的氨基端按正反方向交替排列。从能量上看，反平行式更为稳定。丝 心蛋白和多聚甘氨酸是反平行，拉伸 角蛋白形成的 角蛋白是平行式。反平行式的重复距离是 7.0 埃（两个残基），平行式是 6.5 埃。在丝心蛋白中，每隔一个氨基酸就是甘氨酸，所有在片层的一面都是氢原子；在另一面， 侧链主要是甲基，因为除甘氨酸外，丙氨酸是主要成分。如果肽链中侧链过大，并带有同种电荷，则不能形成 折叠。拉伸后的 角蛋白之所以不稳定，容易复原，就是因为侧链体积大，电荷高。3.转角 转角使 肽链形成约 180的回转，第一个氨基酸的羰基与第四个氨基酸的氨基形成氢键。这种结构在球状蛋白中广泛存在，可占全部残基的1/4。多位于球状蛋白的表面，空间位阻较小处。又分为型、型与 III 型。4.无规