1、收稿日期：2016-04-28 录用日期：2016-08-15基金项目：福州市科技计划项目（2015-S-141-18 ）*通信作者：jiachunfeng_doi:10.6043/j.issn.0438-0479. 201604056骨髓间充质干细胞对实验性变态反应性脑脊髓炎小鼠的治疗作用研究贾春锋 1*，邵林 2，戴庆辰 1，乐立盛 2（1. 厦门大学附属福州第二医院 福建 福州 350007；2. 福州市经济技术开发区医院 福建 福州 350007）摘要：为了探讨骨髓间充质干细胞对小鼠实验性变态反应性脑脊髓炎的治疗作用，将 36 只小鼠随机分为3 组，每组 12 只。分别为正常对照组、模
2、型组和骨髓间充质干细胞（BMMSCs）组。采用不同方法治疗，治疗 8 周后，采用苏木精-伊红（ HE）染色观察小鼠脊髓组织形态学改变； RT-PCR 和 Western blot 分别检测小鼠脊髓组织中细胞因子 IL-1、IL-2、IL-4、IL-6 、IL-10、IL-12 、TNF- 和 IFN- 的 mRNA 水平和蛋白水平。结果显示，与对照组比较，模型组 IL-1、IL-2、IL-12、TNF- 和 IFN- 的 mRNA 水平和蛋白水平上调（p0.05），而 IL-4 和 IL-10 下调（p0.05）；与模型组比较，BMMSCs 组 IL-1、IL-2、IL-12、TNF- 和 I
3、FN- 的 mRNA 水平和蛋白水平下调（p0.05），而 IL-4 和 IL-10 上调（p0.05）。对照组脊髓组织的结构正常，神经细胞形态完好；模型组脊髓组织局部出现明显空洞，而且瘢痕组织、神经细胞非常稀少；BMMSCs 组脊髓组织内没有发现明显空洞及瘢痕组织，而且有大量神经细胞，可见清晰细胞胞体和突起。由上述结果可知，骨髓间充质干细胞对实验性变态反应性脑脊髓炎小鼠具有治疗作用，其机理与抑制炎性蛋白的表达，减少变态反应性脑脊髓炎对脊髓的损伤有关。关键词：变态反应性脑脊髓炎；骨髓间充质干细胞；炎性蛋白中图分类号：R-33 文献标志码：A实验性变态反应性脑脊髓炎（experimental a
4、llergic encephalomyelitis，EAE）是常见的多发性硬化（multiple sclerosis，MS）疾病，MS 的发病特点是以中枢神经系统白质炎性脱髓鞘病变为主要特点的自身免疫病 1。严重影响患者的生活，给患者及其家属带来很大的经济和心里压力。但对这方面的研究目前并不多，需要进行详细的研究。本研究拟建立 EAE 小鼠模型，采用 BMMSCs 尾部静脉注射进行治疗，HE 染色观察小鼠脊髓病理形态变化，RT-PCR 和 Western blot 检测小鼠脊髓组织中白介素-1（IL-1 ）、白介素-2（ IL-2）、白介素-4（IL-4）、白介素-6（IL-6 ）、白介素-1
5、0（IL-10 ）、白介素-12（IL-12 ）、肿瘤坏死因子-（TNF-）和干扰素-（IFN- ）水平表达的变化。初步探讨 BMMSCs 治疗 EAE 的作用机制，为临床治疗 MS 提供新的思路和有力的实验依据。1 材料与方法1.1 材 料选取雄性小鼠 36 只，体质量为(15.21.9) g，购于第三军医大学实验动物中心。DMEM 培养液(广州市左克生物技术有限公司提供) ；胎牛血清( 赛业生物科技集团提供)；II 型胶原酶( 上海玉博生物科技有限公司提供) ；胰蛋白及酶基质胶与 Mdivi-1(美国 Sigma 公司) ； IL-1、IL-2、IL-4、IL-6 、IL-10、IL-12
6、、TNF- 和 IFN- 的 mRNA 试剂盒（上海玉博生物科技有限公司提供）；BMMSCs 购于杭州海瑞化工有限公司（510 6 个 BMMSCs）。1.2 方 法1.2.1 小鼠 BMMSCs 分离、纯化、鉴定及培养将分离的脊髓组织经过磷酸盐缓冲液充分冲洗，并剔除血管后，剩余的间质组织切割成直径约 1 mm大小的组织块，然后采用 0.1 % II 型胶原酶，0.25%胰酶 37 进行消化反应 30 min，离心弃去上清液，剩下的组织块与细胞接种于培养皿，在 DMEM 培养基（含体积分数 5%胎牛血清）中培养。第 1 次传代后每 3 天按 1:3 比例传代，进行扩增培养。取 P3 代细胞，消
7、化后加人 PE FITC 标记的CD73、 CD105、HLA-DR、CD31、VWF 、KDR 、CD34、CD45、CD235a 流式抗体及相应对照标记，流式细胞仪检测 2。1.2.2 小鼠 EAE 模型的建立小鼠麻醉后制成实验性变态反应性脑脊髓炎模型 3。建模成功后将 36 只大鼠随机分为 3 组，每组 12只。根据分组不同进行治疗，分别为正常对照组、模型组和 BMMSCs 组。模型组：C57BL/6 小鼠背部四点皮下注射含 MOC35-55 混悬液各 50 L，同时尾部静脉注射 PTX 300 ng，48 h 后再次尾部静脉注射PTX 300 ng 加强免疫。 BMMSCs 组：注射前
8、调整 BMMSCs 浓度为 5106 mL-1，小鼠尾部静脉缓慢注射500 L 细胞悬液，留针 2 min 后缓慢拔针。1.3 评价指标1.3.1 RT-PCR 检测小鼠脊髓组织中各种炎症因子的 mRNA 水平按照 IL-1、IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-12、TNF- 和 IFN- 的试剂盒说明书进行操作。各炎症因子的引物序列见表 1。首先制备电泳胶，然后按照操作要求将制备好的电泳胶放入电泳槽，同时将 PCR 产物倒入，加入缓冲液（6Loading Buffer），样本混匀后放入电泳胶孔。PCR 反应体系 4：加入10Buffer 2.0 L，2.0 L dNTP，0.4
9、L 上下游引物，0.4 L Taq DNA 聚合酶，1.0 L DNA 模板，双蒸水补足至总溶液体积为 20 L。PCR 反应条件 5：93 预变性 2 min，然后按 93 1 min，55 1 min，72 1 min，共 40 个循环，最后 72 延伸 7 min。PCR 产物与 DNA Ladder 在 2%琼脂糖凝胶电泳，检测 PCR 产物是否为单一特异性扩增条带，并采用灰度分析软件进行分析。表 1 各种炎症因子引物序列Tab. 1 Sequences of inflammatory cytokines炎症因子 引物序列上游：5-CCAAGACCAGGTACCATG-3IL-1下游：
10、5-GGTTCTGGTCCATGGTAC-3上游：5-GCCAGGGTTTTCCCAGT-3IL-2下游：5-ACTGGGAAAACCCTGGC-3上游：5-CTCGGGAAGCGCGCCATTGTGTTGG-3IL-4下游：5-CCAACACAATGGCGCGCTTCCCGAG-3上游：5-ATACGACTCACTATAGGGCGAATTGGC-3IL-6下游：5-GCCAATTCGCCCTATAGTGAGTCGTAT-3上游：5-TCAGTGTTAGACTAGTAAATT-3IL-10下游：5-AATTTACTAGTCTAACACTGA-3上游：5-CCAAGACCAGGTACCATG-3
11、IL-12下游：5-CATGGTACCTGGTCTTGG-3上游：5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3TNF-下游：5-CTGAGCCAGGATCAAACTCT-3上游：5-CTCCGAGATCTGGACGAG-3IFN-下游：5-CTCGTCCAGATCTCGGAG-3上游：5-AGTTGCGTTACACCCTTTC-3-actin下游：5-CCTTCACCGTTCCAGTTT-31.3.2 Western blot 检测小鼠脊髓组织中各种炎症因子的蛋白表达水平 5小鼠脊髓组织细胞经过处理后，采用各种炎症因子的蛋白抗体，37 孵育 36 h，弃去培养液，用PBS 冲洗 3 次，然
12、后用蛋白裂解液使细胞裂解，放置于冰上保持 5 min 后，样品加入 1/4 体积的 4蛋白上样缓冲液，沸水煮沸 5 min，进行 SDS-PAGE 凝胶电泳，然后转印至 PVDF 膜上，用含按约 0.1 mL/cm2 量加入封闭液封闭 1 h，一抗 4 过夜。次日 PBST 漂洗 3 次，加入辣根过氧化酶标记的二抗室温孵育 2 h，ECL 显色。用 SDS-PAGE 进行电泳，并将其转膜到硝酸纤维素膜上。对抗体孵育处理，经化学发光法曝光后观察结果。1.3.3 H compared with the model group, in the BMMSCs group, IL-1, IL-2, IL
13、-12, TNF-, IFN-, IL-4 and IL-10 mRNA level had significantly different (p0.05). Normal control group, the spinal cord tissue structure, morphology of nerve cells intact; spinal cord tissue of model group were locally significant voids, and scar tissue, nerve cells are extremely rare; BMMSCs group wi
14、thin the spinal cord tissue showed no significant voids and scar tissue, and there were a large number of nerve cells, clearly visible cell bodies and processes. Taking together, it is suggested that BMMSCs have therapeutic effects on experimental allergic inflammatory response in mice and the mechanism is related to inhibiting the expression of inflammatory proteins and reducing the damage to the spinal cord.Key words: allergic encephalomyelitis; bone mesenchymal stem cells; inflammatory protein
