1、慢性乙肝致炎的细胞分子机制孙琳 毕惠娟 王健摘要：慢性乙肝是一种由 HBV 介导的以肝脏局部多种炎性细胞浸润的慢性感染性疾病。HBV 侵入机体后能否形成慢性感染与病毒是否变异、宿主抗病毒免疫应答强弱等因素密切相关。免疫耐受、Th1/Th2 失衡、HBV 肝外 PBMC 感染等是导致乙肝持续感染迁延难愈的重要原因。机体对在清除侵入的病毒时，可对受感染的肝细胞产生一定程度损伤，如 CTL 通过分泌穿孔素和表达 Fasl 等途径诱导靶细胞凋亡；肝脏中嗜中性粒细胞和单核巨噬细胞通过产生反应氧（ROS） 、一氧化氮（NO ）等反应氮等中间产物，介导损伤受感染的肝细胞，在局部形成以单核/巨噬细胞浸润为主炎
2、性损伤和炎性反应。关键词：慢性乙肝；致炎；分子；机制慢性乙肝是一种由 HBV 感染引起的以局部单核细胞、淋巴细胞及中性粒细胞等炎症细胞的浸润为主的感染性疾病。全球约慢性乙肝约有 3.54 亿，其中，我国约有 3000 万。HBV 侵入机体后，一方面，在宿主细胞内复制增殖，产生大量病毒抗原，诱导机体产生大量的调节性 T 细胞，对全身免疫系统造成很大压力，致使机体免疫功能低下。另一方面 HBV 作为一种抗原，诱导机体的细胞免疫反应对其产生免疫清除，此过程可引起部分肝细胞损伤，介导局部炎症细胞浸润，机体为保护肝细胞不受过度损伤，肝细胞自身可表达一些免疫抑制分子，通过与相应的受体或配体结合，形成免疫抑
3、制途径，抑制宿主的抗病毒免疫应答，使病毒持续复制增殖，病程慢性化。本文围绕国内外慢性乙肝致炎的细胞分子机制研究进展进行综述。1. HBV 的结构HBV 是一种部分环化的双股 DNA，由一条较长且固定的负链(3200bp)和一条较短长度不定的正链(400-1900bp)组成，两链的 5末端有长达 250300 个互补的碱基，通过碱基配对构成部分环化的双股 DNA 结构。1970 年 Danes 通过电镜从澳大利亚土著人血液中发现了完整的乙肝病毒颗粒，2009 年 Kamili 等 1以免疫电镜观察用抗-HBs 的多克隆抗体处理样品，发现还存在 22nm 丝状的亚病毒颗粒；1979 年 Galib
4、ert 等将 HBV-DNA 负链划分为 4 个开放读码框(open reading frame, ORF)，其总长为4.7kb，分别为 S、 C、P、X 区。S-ORF 长度为 1185bp，有 S、Pre-S1 和 Pre-S2 3 个功能区，编码外膜蛋白。S 区定位于nt155-833，由 678 个核苷酸组成，编码 226 个氨基酸的 S 蛋白，主要是小蛋白（Small protein, SP）或表面抗原，即 HBsAg，是 HBV 疫苗研制的靶点。Pre-S1 基因长度不定，定位于 nt2848-3204，编码 119 个氨基酸残基，是 HBV 与肝细胞膜直接结合位点 2。董菁等 3
5、应用长距离精确 PCR 技术（LA-PCR ）研究发现在 Pre-S1 区之前还存在一个 ORF，暂命名为前-前-S ORF，长度 135bp，编码 45 个氨基酸。Pre-S2 基因长度固定，定位于 nt3205-154，编码 55 个氨基酸外膜蛋白，具有很强的免疫原性，其 120145 位氨基酸残基是 HBV 的重要免疫原性决定区，可诱导中和抗体的产生，研究证实 Pre-S2 蛋白含有聚合人血清白蛋白（PHSA）受体，肝细胞表面也存在 PHSA-R，这样 HBV 颗粒可通过 PHSA 与肝细胞膜结合，从而介导 HBV 入侵肝细胞，成为 HBV 侵入肝细胞的主要途径 4。C-ORF 分为 C
6、 区和前 C 区，分别编码 183-185 个氨基酸的多肽即 HBcAg、29 个氨基酸的残基和核衣壳蛋白 HBeAg。HBcAg 和 HBeAg 是由同一基因编码，序列大部分相同，都是抗病毒免疫的重要靶位。前 C 区极易发生突变，可造成 HBeAg 的分泌水平下降或终止。P 区是 HBV DNA 序列中最长的 ORF，与 S、C、X 基因均有重叠，编码 P 蛋白，是病毒复制的主要功能单位。P 区包括 4 个编码区域，从氨基端开始分别为：末端蛋白区(TP) ，逆转录过程中与负链 DNA5端结合，引导 HBV 负链的合成。间隔区( SD)，该区耐受突变。逆转录酶区(RT)，该蛋白同时具有依赖 R
7、NA 的 RNA 聚合酶活性和依赖 RNA 的 DNA 聚合酶活性。核糖核酸酶(RNase) H 区，它可裂解逆转录过程中形成的 RNA-DNA 杂交体中的 RNA。X 区位于 C 区的上游，是病毒基因中最小的 ORF，其编码含 145154 个氨基酸的蛋白质HBx。Yang 等 5对研究发现在 HBV 基因组中存在 Pre X 基因，将 HBV 基因通过 PCR 法扩增并转载至质粒中进行克隆全基因组序列分析，发现 60%的 HBV 基因编译 Pre-X 蛋白，Pre-X 蛋白可通过反式激活病毒增强子促进 HBV 的复制，HBx 还可激活 DNA 合成从而促进静止的成纤维细胞增殖。2. HBV
8、 的复制HBV 病毒通过特异性受体结合至宿主细胞膜后，通过吞饮或融合的方式穿入细胞膜，脱去蛋白质衣壳，将病毒 DNA 基因组释放入细胞核，在细胞 DNA 聚合酶和 RNA 聚合酶的作用下形成共价闭合环状 DNA（covalent closed circular DNA, cccDNA） ，其作为 HBV 复制的原始模板，转录成为各种不同分子量的 mRNA，主要有 3.5Kb mRNA、2.4Kb mRNA、2.1KbmRNA 及 0.7Kb mRNA（Fig2） 。3.5Kb mRNA 称为 HBV 前基因组，它可以作为 HBV DNA 的模板，由 P 蛋白逆转录成全长的 HBV DNA 负链
9、，病毒以新合成的负链 DNA 为模板，自 DR 区开始复制互补的正链 DNA，两者结合成不完全环状双链 DNA 即 HBVrcDNA。新基金项目：安徽省自然科学基金（No:090413138） ，安徽省教育厅自然基金重点项目（No:KJ2009A032、KJ2007A019）作者单位：安徽理工大学医学院妇产科护理学教研室 淮南 232001作者简介：孙琳（1964-） ，女，副主任医师，发表论文 10 余篇，获市级科技进步奖 1 项。研究方向：HBV 垂直传播与免疫。通讯作者：王健（1962-） ，男，教授，硕士生导师。 E-mail：合成的 HBVrcDNA 一方面进入细胞核内转化成新的 c
10、ccDNA，补充细胞内的 cccDNA 库；另一方面与病毒蛋白装配成新的完整的 HBV，释放至胞外。上述二个转录过程均须依赖 HBV DNA 多聚酶的催化。3.5Kb mRNA 的另一种功能是可以表达HBeAg、HBcAg 和 DNA 多聚酶；2.4Kb mRNA 可以表达 HBsAg 和前 S 蛋白（包括前 S1 和前 S2 蛋白） ；2.1Kb mRNA 可以表达 HBsAg。0.7Kb mRNA 可表达 X 蛋白。3. HBV 感染后机体的免疫反应HBV 特异性细胞毒性 T 细胞在控制 HBV 感染及其清除过程中起着重要作用。机体感染 HBV 后，首先被抗原提呈细胞（antigen-pr
11、esenting cell, APC）摄取，在 APC 胞内降解成免疫原性多肽，与 MHC 分子结合，经高尔基体转运到 APC 表面。CD4+T 细胞识别抗原提呈细胞上经加工的 HBV 病毒抗原肽-MHC-类复合物，CD8 +T 细胞则识别病毒抗原肽-MHC-类分子复合物；TCR 与 APC 表面的抗原肽-MHC 分子复合物结合并交联，使与受体相连的激酶如 Fyn 活化，导致 CD3 分子胞浆区的免疫受体酪氨酸活化基序（immunoreceptor tyrosine-based activation motifs, ITAM）发生磷酸化，酪氨酸激酶 ZAP-70 结合到已磷酸化的ITAMs 上
12、。CD4 携带的 p56Lck 再促使 ZAP-70 磷酸化而活化。一方面，活化的 ZAP-70 使接头蛋白（LAT, SLP-76）磷酸化，它们与含有 SH2 结构域的磷脂酶 C-（phospholipase C-, PLC-）结合，使之活化，并裂解细胞膜上的磷脂酰肌醇二磷酸（phosphatidylinositol bisphosphate, PIP2）产生三磷酸肌醇（inositol triphosphate, IP3）和甘油二酯（diacylglycerol, DAG） 。IP3 可激活膜离子通道，使 Ca2+流入胞内，并开放胞内的钙储备，释放 Ca2+，胞浆内 Ca2+浓度升高可活化
13、钙调磷酸酶（calcineurin） ，进而使转录因子 NFAT（nuclear factor of activated T cell）去磷酸根，由胞浆转移至核内；DAG 在胞膜内面结合并活化蛋白激酶 C（protein kinase C, PKC） ，使 IB 与 NF-B（nuclear factor-B）解离，转录因子 NF-B 转位至核内，将活化信号传至核内。另一方面，活化的 ZAP-70 可经 Ras 活化丝裂原激活的蛋白激酶（mitogen activated protein kinase, MAPK）级联反应，将活化信号传至核内，从而调控效应 T 细胞的增殖及分化来发挥其抗病毒作
14、用。CTL 在 HBV 感染的免疫过程中，识别肝细胞表面的靶抗原，通过产生穿孔素及表达 FasL 诱导靶细胞凋亡。另一方面，CTL 还可以产生细胞因子 IFN- 和TNF-，降解 HBV RNA，从而抑制 HBV 病毒在肝内的复制。近来有研究表明，由细胞因子介导的非溶细胞性抗病毒清除机制也发挥了重要作用 6。非细胞溶解清除 HBV 的本质是通过多种细胞因子介导的清除细胞内 HBV 转录模板 cccDNA 和 HBV复制中间产物的过程。特异性 CTL 和非特异性免疫细胞共同的作用在乙肝急性早期非溶细胞性病毒清除中起着重要作用。它们通过产生效应细胞因子发挥清除 HBV 作用，IFN-/ 通过诱导细
15、胞产生抗病毒蛋白来发挥抗病毒功能。 IFN- 还可诱导组织通过自分泌或旁分泌的形式产生一氧化氮（NO）来发挥抗病毒作用。NKT 细胞和专职 APC 细胞主要是通过产生 IFN-/ 发挥抗病毒效应；CD8 +T 细胞则主要是通过产生 IFN- 发挥抗病毒效应，这种非溶细胞作用避免了免疫所介导的大量细胞的破坏，从而保存重要器官功能的完整性。肝脏是一个富含免疫细胞的脏器。HBV 感染肝细胞后，受感染的肝细胞可以迅速识别病毒双股 RNA（dsRNA） ，分泌干扰素 /（IFN-/） ，后者诱导细胞合成抗病毒蛋白，抑制抗病毒蛋白质的合成。IFN-/、IFN- 可有效地趋化并激活巨噬细胞、NK 细胞、树突
16、细胞、NKT 细胞等天然免疫细胞，Webster 等 7发现 NKT 细胞在人体感染 HBV 后出现临床症状之前已有大量聚集，发挥细胞免疫效应功能，抵抗 HBV 感染。4. HBV 慢性感染的细胞分子机制HBV 侵入机体后，形成慢性感染与宿主抗病毒免疫应答强弱密切相关。当机体的免疫系统能够完全清除病毒，即可痊愈，当免疫系统未发育成熟或者机体免疫低下，不能彻底清除病毒，使机体 HBV 感染慢性化。近年来研究证实，免疫耐受、辅助细胞 Th1/2 的失衡、高 HBV DNA 血症以及乙型肝炎病毒的变异在 HBV 感染的慢性化过程中起重要作用。4.1 免疫耐受机制免疫耐受（immune toleran
17、ce）是一种机体对抗原刺激表现为特异性的“免疫不应答”现象。许多研究表明，免疫耐受是HBV感染慢性化最主要的机制。对机体而言，免疫耐受与机体免疫系统发育成熟程度有关，而免疫系统的发育又与年龄密切相关。有研究显示，新生儿期感染HBV转为慢性乙型肝炎的比率是95% ，这与新生儿免疫系统尚未发育成熟有关。胎内或围产期感染HBV后，体内T细胞将其作为自身抗原加以识别，进而可导致HBV特异性T细胞凋亡和克隆清除（clone deletion） ，此为胎儿感染HBV慢性化的主要原因。宿主抗原提呈功能减弱是诱导免疫耐受的重要因素。通过氨基酸序列分析发现，HBeAg和HBcAg 约有75%共同的氨基酸序列，但
18、是两者的二级结构不同，各有特异的抗原决定簇。HBcAg是一种颗粒性细胞内抗原，不能通过胎盘，但HBeAg 作为一种非颗粒性分泌型小分子蛋白，能通过胎盘分泌入血，经血液循环到达胸腺。Song等 8在脐带血中测得HBeAg 阳性率为56.9%,而有的研究更是高达88%。由于抗原提呈细胞功能缺陷，导致主要组织相容性复合物HLA-限制的HBeAg特异性Th细胞功能缺失，表现为HBeAg特异性T细胞耐受，由于两者在T细胞识别水平上有交叉反应性，又表现为 HBcAg的免疫耐受，HBeAg/HBcAg特异性Th 耐受可阻止抗HBe和抗HBc的产生，削弱了细胞毒性T 细胞的应答能力，导致病毒的持续感染，此可能
19、是导致HBsAg 、HBeAg阳性母亲所产新生儿高感染率及慢性化的主要原因。有研究表明，CTL可刺激T细胞受体TCR/CD3复合物，诱导自身Fas及其配体、肿瘤坏死因子及其受体等凋亡效应因子的表达，通过受体-配体和细胞内凋亡信号传递，诱导 T细胞自身凋亡。宿主感染HBV后，若病毒抗原滴度较高，TCR/CD3 复合物所致的刺激就较强，使特异性CTL产生活化诱导的细胞死亡(activation-induced cell death, AICD)，致“克隆衰竭”或在高浓度的包膜抗原作用下处于麻痹状态，导致感染慢性化 9。近年来，有研究发现Th1/Th2 失衡可能是HBV感染慢性化的重要机制。1986
20、年Mosmann等首次通过小鼠T细胞克隆性分析将Th 细胞（CD4 +T细胞）分为Th1、Th2两个功能不同的亚群。目前研究可知Th0 细胞在IL-12的作用下分化为Th1细胞，在IL-4作用下分化为Th2细胞。Th1、Th2亚群分别产生不同的细胞因子， Th1细胞以分泌IL-2、IL-12、IFN- 和TNF-为主，主要参与细胞介导的免疫反应及细胞毒作用，并在抵御病毒等细胞内致病因子方面起重要作用。因此Th1 细胞占优势，细胞免疫加强，肝脏的炎症反应较强烈，有利于HBV清除，倾向于发生急性自限性感染；Th2细胞则以分泌IL-4、IL-5、IL-6、IL-10 等为主，主要介导机体的体液免疫反
21、应，在抵御细胞外致病因子方面发挥作用，Th2 细胞占优势，机体清除病毒的能力下降，倾向于发生HBV感染的持续慢性化。越来越多的研究表明，Th1/Th2 失衡在机体免疫应答平衡中起着关键作用。病毒性肝炎的进展、预后与宿主免疫功能状态密切相关，Th1/Th2 失衡与HBV 感染后的转归有着密切的关系。Akpolat等 10应用ELISA方法测CHB患者血清中的TNF-、IL-4 、TGF-1 水平均较对照组(肝脏的生物化学水平维持在正常水平)水平高，而IFN- 水平较对照组的水平低，并进一步证实IL-4、IFN-在HBV的慢性化进程中发挥重要的作用。慢性乙肝患者体内存在着细胞免疫功能的紊乱，HBV
22、感染致机体Th1/Th2 比例失衡，使HBV感染慢性化。外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells, PBMC）富含各种免疫活性细胞，是免疫细胞的集合体，主要为T淋巴细胞，其在机体的免疫应答中极为重要。有研究显示，HBV除对肝细胞具有高度亲和性外，还可侵犯PBMC 以及淋巴结、脾等免疫活性组织细胞 11-14，并表达病毒抗原，被特异性CTL识别并杀伤，未被感染的T细胞也可和可溶性HBV抗原结合而被特异性CTL识别和破坏，导致抗原的提呈功能减弱，相关抗体及免疫活化分子产生不足，导致HBV感染慢性化。2008年，王健等 15用 PCR的方法对157例乙肝
23、患者PBMC内HBV-DNA进行检测，并采用 BSA系统平行检测其CD3+、CD4 +、CD8 +、CD4 +/CD8+和mIL-2R表达水平，发现CD3 +、CD4 +水平较正常对照组显著下降，CD8 +水平增高，二者比值下降，表明乙肝患者体内存在明显细胞免疫功能低下，与免疫细胞受到HBV的感染密切相关。4.2 HBV 免疫逃避策略机体的某些组织、器官存在一些生理性内皮屏障，导致HBV感染淋巴细胞无法到达组织或细胞不表达MHC 类分子而无法参与免疫应答而逃避宿主免疫性清除。研究表明，这些组织主要包括肾、胰腺、脑以及一些内分泌组织如睾丸、卵巢、肾上腺等，由于微血管屏障的存在，HBsAg特异性C
24、TL不能到达HBsAg阳性的实质细胞部位，从而逃避机体的免疫，但是它提供了一个潜在的病毒库，通过持续释放病毒，反复感染肝细胞等导致感染慢性化。HBV基因组各个区段都可发生变异。当病毒侵入人体后，在各种选择性压力作用下可发生变异来逃避机体的免疫攻击。这些变异的HBV DNA可引起病毒复制和表达能力下降，使机体免疫细胞识别的抗原减少或缺失，从而逃脱宿主的免疫监视。变异的HBV病毒抗原与HLA或TCR结合活性下降或者变异抗原与HLA或TCR 结合后使其空间构象发生改变，致使变异抗原不能活化T细胞，而且占据TCR结合位点，产生对野生型抗原识别的拮抗作用 16，从而干扰免疫系统对HBV 抗原的加工、提呈
25、、识别和T细胞活化，最终导致T细胞对靶抗原的免疫耐受。HBsAg“”决定簇是HBV各亚型的共同决定簇，具有高度免疫原性和序列保守性，S基因变异多集中在此，最常见的是G145R变异，即突变发生在 145位氨基酸残基上，由甘氨酸变为精氨酸从而引起构型发生改变， “”决定簇结构的变异可导致HBsAg免疫原性、抗原性的改变，使之不能与单克隆抗抗体及免疫疫苗接种后抗体或恢复期血清抗体结合或结合力下降，导致HBV清除能力下降，形成免疫逃避 17。Waters等 18通过体外实验证明了G145R突变株的免疫原性及与抗-HBs的结合力均发生明显变化。另外S基因的变异还可出现HBsAg阴性的HBV感染。PreC
26、基因是HBV基因组的高变区。1989年Carman等 19首次报道了PreC基因nt1896GA突变，这种突变是最为常见的，可导致HBeAg合成终止，从而使血清中HBeAg呈阴性。对于由T细胞和抗体介导的免疫应答来说，HBeAg是重要的靶抗原，HBeAg的缺失将导致HBV感染的肝细胞表面靶抗原减少，从而降低特异性CTL的识别效率。C基因97L 变异株在自然感染中最常见。这种变异可导致HBV不成熟分泌，降低病毒复制效率，降低抗原提呈的量，其突变的表位虽能与CTL上的TCR结合，但不能传递刺激信号而造成CTL无能。X蛋白是重要的靶抗原，其可转运增强子（Enh ）和核心启动子（BCP）从而刺激病毒的
27、表达与复制。X区是病毒转录控制区，它能在体内外广泛激活C区、pre-C区、pre-S2 和核心启动子- 增强子复合体。当HBxAg突变时，这种反应激活力下降，病毒复制下降，机体抗病毒免疫应答相对减弱，从而诱导部分免疫耐受。Kohno等 20在抗HBeAg阳性病人中检出8个核苷酸（ nt1768-1775）的缺失突变，所产生截短的X蛋白反式激活作用明显减弱，并检测到前C和前基因组的mRNA的转录减少以及HBeAg表达的明显减少。Lee等 21实验发现C基因发生157个核苷酸（nt331-491 ）或122个核苷酸（nt327-448）的缺失突变时能逃避免疫系统的攻击，其主要原因是其突变后失去了T
28、 细胞的抗原结合位点。许多研究表明，HBV基因组突变，基因表达不完全或HBV感染肝外免疫豁免区等，都可导致HBV逃避宿主免疫系统清除。5. HBV长期感染致慢性炎症和免疫损伤免疫病理损伤是指机体的免疫反应在清除病原体时，在一定程度上损伤人体正常细胞或诱导纤维化而破坏人体器官结构和功能，其炎性损伤程度、持续时间与病毒致病力和宿主免疫状态有关。5.1 炎症细胞浸润在正常情况下，炎症反应是保护机体因抵抗病毒感染的基本病理生理过程；但是，过强的炎症反应也可导致正常组织的损伤。在病毒的感染初期，淋巴细胞的浸润是非特异性的，当特异性致敏的淋巴细胞与病毒抗原相互作用，可刺激其释放细胞因子，如 IL-8、 I
29、P-10等，趋化中性粒细胞及单核巨噬细胞的活化游走 22-28，这些免疫细胞在病毒感染部位可释放多种水解酶及炎症介质如 LTs、IL-1、IL-6、IL-8、IFN- 和 TNF- 等，引起肝脏组织局部充血、水肿及细胞坏死等一系列炎症反应。1999年，Wang 等 29选择66例乙肝患者通过 ELISA 法检测其血清 TNF-、IFN-、IL-6、IL-8水平，并以20例正常献血者作为对照，发现在乙肝患者血清中 TNF- 和 IL-6明显增高（P0.05)，在爆发性乙肝患者体内 TNF-、IFN- 、IL-6、IL-8水平明显高于急性乙肝患者，且发现在急性肝炎初期和爆发性肝炎肝昏迷早期阶段 I
30、FN- 水平达到高峰，TNF-、IL-6、IL-8 水平也随之升高，在肝脏损伤最严重时达到高峰，随着病人病情的改善而减少。2005年，Akpolat 等 30选取30例（男24例，女6例，平均年龄26岁）未接受任何治疗的慢性乙肝患者和30例（男18例，女12例，平均年龄22岁）健康人作为阴性对照，通过肝穿刺活检，并采用 ELISA 法检测慢性乙肝患者和对照组血清中 TGF-、IFN-、TNF- 及 IL-4水平，发现慢性乙肝患者 TGF-、TNF- 及 IL-4水平明显高于正常对照组，而 IFN- 水平则低于对照组；通过相关性分析发现，IL-4和 IFN- 与乙肝慢性化过程相关，而 TGF-
31、与肝脏的纤维化明显相关。5.2 靶细胞的破坏清除病毒感染的靶细胞通常由细胞免疫介导，其中 HBV 特异性细胞毒性 T 细胞（CTL）起着重要的作用。CTL 导致炎症的途径包括通过分泌穿孔素和表达 Fasl 等途径诱导靶细胞凋亡以及通过分泌细胞因子发挥抗病毒作用。清除感染肝细胞内的病毒同时伴有一定程度肝细胞破坏及肝细胞功能受损。Tang 等 31应用免疫组化法探讨肝内 CTL、Kupffer 免疫效应细胞在慢性乙肝局部炎性损伤中的作用，共选择 47 例不同程度 ALT 异常的慢性乙肝肝活检组织标本，并以急性乙肝和正常肝组织为对照，采用免疫组化染色定量检测肝小叶、门管区免疫效应细胞、细胞毒效应分子
32、、细胞因子产生细胞的表达水平，结果显示 ALT 增高患者肝小叶内 CD8+的 T 淋巴细胞显著增加( r=-0.54，P0.001)，ALT 增高水平不仅与门管区粒酶阳性细胞呈正相关(r=0.65，P0.001)，而且与肝小叶内 Fas-L 阳性细胞（Fas-L 表达于 Kupffer 细胞和淋巴样细胞）呈正比。肝内 CD8+T 淋巴细胞多见于 HBeAg(-)患者，低病毒载量和 HBeAg(-)者病毒复制水平低与其肝小叶内 CD8+的 T 淋巴细胞增加有关。慢性乙肝的炎性损伤不仅是肝内 CD8+T 淋巴细胞浸润的结果，而且与 Kupffer 细胞表达 Fas-L 和门管区溶细胞活性增加有关。
33、Sitia 等32通过 HBV 转基因小鼠动物模型，以高迁移率组蛋白 1(high-mobility group box 1 protein, HMGB1)抑制剂减轻因 CTL 细胞介导的肝细胞损伤，在转基因小鼠中，CTL 细胞可使 HMGB1 从肝细胞核移位至肝细胞浆，用 CTL 和重组 Box-A 或甘草酸联合注射转基因小鼠，HMGB1 可发挥双重的细胞外抑制功能，以减少肝内多形核中性白细胞和其它炎性细胞浸润，减轻肝细胞损伤，提示其可作为一种较理想的炎症抑制剂用于慢性乙肝的治疗。由多形核中性粒细胞产生的丝氨酸蛋白酶在中性粒细胞介导局部组织损伤中起重要作用。Takai 等 33采用阻断中性粒
34、细胞弹性蛋白酶(neutrophil elastase, NE)活性可减轻转基因小鼠的严重肝损伤。当转基因小鼠注射抗原特异性 CTL 细胞后 824h，采用 NE 抑制剂可降低血清 ALT 水平和局部炎症细胞浸润，同时，还能减轻巨噬细胞产生的细胞因子、趋化因子、肿瘤坏死因子分泌表达；另外，注射抗原特异性 CTL 细胞 8h 后，NE 抑制剂还能抑制 CCL3、CCL4、MIP-2 在肝内的 mRNA 表达；抗-CCL3、抗-CCL4、抗-MIP-2 的单克隆抗体可抑制血清 ALT 分泌和中性白细胞向肝内聚集，此对抑制肝脏炎症的级联反应有重要意义。5.3 免疫复合物引起组织损伤慢性乙肝患者由于其
35、感染病程长、易迁延不愈，体内能不断提供足够的抗原，与机体产生的相应抗体结合生成抗原抗体免疫复合物，参与此型反应的抗体通常为 IgG 或 IgM 型，病毒的一种或多种亚单位如 HBsAg、HBcAg 和 HBeAg 作为抗原与之结合，当抗原抗体比例适当可形成中等大小的免疫复合物，这种免疫复合物由于分子量较多，不易通过肾小球排出体外，又不易被 M 吞噬，随着体液循环，在一定条件下可沉积于全身或局部毛细血管基底膜或滑膜囊、组织间隙等，激活补体，释放 C3a、C5a 等生物活性物质，吸引中性粒细胞等吞噬细胞清除这些复合物，并释放溶酶体酶等多种水解酶类，而使沉着部位出现炎症反应，破坏周围组织，从而导致病
36、理损伤。2009 年，Glebe 等 34以急性和慢性感染肝炎病毒的土拨鼠为动物模型研究土拨鼠肝炎病毒（WHV）与宿主循环免疫复合物之间的相关性，由于土拨鼠肝炎病毒（ WHV）与 HBV 具有相同的生物学特性、基因组及复制模式，因此可通过 WHV 感染的土拨鼠作为动物模型，研究土拨鼠肝炎病毒（ WHV）与循环免疫复合物之间的相关性间接的反应 HBV 病毒与宿主的循环免疫复合物之间的相关性。Glebe 等通过对 6 只成年土拨鼠静脉注射1*107 WID50 的 WHV7P1，然后通过 PEG 沉淀进行 Western blot 法检测发现三只土拨鼠 F3391、F3539、F3524 在感染后
37、的最初45 周可检测到循环免疫复合物，且与 WHV 病毒血症高峰和 WHs 抗原血症有关。土拨鼠 F3538 在病毒感染后的第 1 周和第6 周可检测到循环免疫复合物，在另外三只于感染后的第 56 周被检出，所有的土拨鼠在感染后最初的 24 周免疫复合物的水平达到最高，随后开始下降。WHsAg 和抗 WHsAg 抗体形成的循环免疫复合物 CICs 与血清中的病毒血症和 WHs 抗原血症浓度呈短暂相关，且当血清中存在游离的抗-WHs 时这种免疫复合物不能被检测到，这些结果均提示机体抗 WHsAg 体液免疫在早期清除外周血病毒及其亚病毒颗粒中发挥重要作用。有研究显示，慢性乙型肝炎患者的肾脏、关节囊
38、以及皮肤小动脉有HBsAg、 HBcAg 和 HBeAg 免疫复合物和补体成分的沉积。因此，免疫复合物在局部组织的沉积是引起慢性肝炎肝外表现的主要原因。此外急性乙型肝炎前驱期血清样综合症也是由免疫复合物所引起的。5.4 自身免疫反应自身免疫反应是机体对自身组织成分或细胞抗原失去免疫耐受性，导致自身免疫效应细胞和抗体对自身组织进行病理性免疫应答，引起组织结构的损伤。肝炎病毒感染诱发的自身免疫反应在慢性乙肝的发病机制中发挥重要的作用。近年来，研究显示肝炎病毒感染患者体内可检测到多种自身抗体如抗-LSP（肝脏衍生的脂蛋白复合体） 、抗-HL（肝脏血凝素）等，而且在自身免疫疾病患者血清中也可检测到病毒
39、抗原和抗病毒抗体。临床上慢性乙肝患者可伴发结节性多动脉炎、关节炎和肾小球肾炎等肝外病变 35。HBV 是一种泛嗜性病毒，可感染 T 细胞并在其中复制、增殖，诱导 T 细胞表面表达特异性病毒抗原。因此 Ts 细胞及 Ts细胞的诱导细胞可能成为机体免疫系统攻击的对象，从而引起 Ts 细胞功能的下降，进而导致 Th 细胞功能增强，释放多种细胞因子，如 IL-2、 IL-4等激活自身反应性 B 细胞，使其产生针对 LSP 和 LMAg 等的自身抗体。1988年，Vento 等 36对5例受试者分别通过 T 淋巴细胞迁移抑制因子实验和放射性免疫法检测被试者体内对 LSP 及 HL 产生的细胞和体液反应，
40、发现其中4例受试者在 HBV 感染早期可检测到抗-LSP 和抗-HL 自身抗体。此外，Th 细胞还可辅助自身反应性 T 细胞的溶细胞作用。HBV病毒是 IFN- 强诱导剂，也可诱导产生 IFN- 和 TNF，增加 HLA-类抗原的表达，有利于 MHC-抗原限制性 CD8+自身反应性 T 细胞的杀伤作用的发挥。但在肝炎病毒诱导的自身免疫中 HLA-类抗原更为重要。IFN- 是 HLA-DR 表达的主要诱导物，它可能是病毒直接诱导的结果。HLA-DR 的异位表达可见于急性和慢性乙型肝炎患者的肝细胞上，并证明肝组织内存在表达 HLA-DR 抗原的肝细胞均有 HBV 复制。病毒抗原的分子模拟是指病毒抗
41、原与宿主正常组织之间存在氨基酸序同源序列而具有相同或类似的抗原结构，当机体的免疫系统对病毒抗原进行识别而触发免疫应答时，可引起机体的免疫系统对宿主正常组织的免疫应答，病毒特异性的抗体可与机体正常的细胞蛋白质发生交叉反应。1999年，Gregorio 等 37研究发现在慢性乙肝患者体内存在抗核抗体（ANA ）和抗平滑肌抗体（SMA）等自身抗体，为探究其来源，发现 HBV-DNA 聚合酶和细胞核蛋白（MHC- 反式激活剂、核孔复合体蛋白、核有丝分裂器、多发性硬化症抗原）及平滑肌蛋白（钙调蛋白、肌凝蛋白）存在79个相同的氨基酸序列；进一步观察65例慢性乙肝儿童患者，104例其他慢性肝炎患者（CLD）
42、 ，36例肝外的自身免疫疾病患者和24例健康对照组血清内对 HBV-聚合酶及其相关的同源物（6种与 HBV 聚合酶具有高度同源性的核抗原和平滑肌抗原）的免疫反应，发现40%HBV 阳性患者血清中同时存在这两种反应，在其他慢性肝炎患者组只占4%（4例） ，在肝外自身免疫疾病组中占6% （2例） ，在健康的对照组中未见（P 0.001） 。通过免疫荧光法与免疫印迹法检测发现机体对肌凝蛋白和肌钙蛋白以及 HBV 聚合酶的免疫反应与机体抗平滑肌抗体阳性、及体内的天然蛋白有关（P0.05） 。在 HBV 感染患者体内自身蛋白质与 HBV 病毒氨基酸序列的同源性引起的交叉免疫反应在自身抗体的产生过程中发挥
43、重要作用。此外，病毒感染细胞后，还可通过使宿主细胞抗原暴露、释放、改变或插入等诱发机体的自身免疫反应。一方面，HBV 病毒的基因可整合到宿主基因中，成为宿主基因的组成部分，随着宿主基因在子代细胞中转录、翻译表达，从而使肝细胞膜结构发生改变，从而导致机体的免疫系统把自身的肝细胞误认为异物或自身抗原进行免疫清除；另一方面，HBV 是一种细胞膜芽生病毒，可将肝细胞膜抗原掺入其包膜中，这种新的结合物具有很强的免疫原性，可诱导肝细胞膜抗原的反应。综述所述，HBV 慢性化与宿主抗病毒免疫应答强弱、病毒免疫逃避等因素密切相关。CTL 通过产生穿孔素及表达 FasL诱导靶细胞凋亡，在抗 HBV 感染中起重要作
44、用，但亦可对受染肝细胞产生一定程度损伤。当致敏淋巴细胞与 HBV 相互作用，可刺激其释放多种细胞因子、趋化因子，趋化中性粒细胞及单核巨噬细胞的活化游走，在局部形成以单核/巨噬细胞浸润为主炎性损伤和炎性反应。免疫耐受、Th1/Th2 失衡、HBV 肝外 PBMC 感染等是导致乙肝持续感染迁延难愈的重要原因。参考文献1 Kamili S, Sozzi V, Thompson G, et al. Efficacy of hepatitis B vaccine against antiviral drug-resistant hepatitis B virus mutants in the chimp
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