1、实验四：乳粉中蛋白质的检测一、实验目的：掌握凯氏定氮法测牛乳中蛋白质的原理与方法。二、实验原理：蛋白质是含氮的有机化合物。食品与硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋白质分解，分解的氨与硫酸结合生成硫酸铵。然后碱化蒸馏使氨游离，用硼酸吸收后，再以硫酸或盐酸标准溶液滴定，根据酸的消耗量乘以换算系数，即为蛋白质的含量。（1）消化试样与浓硫酸和催化剂一同加热，使有机质破坏，蛋白质分解，其中碳和氢完全被硫酸的分解物氧化为二氧化碳和水逸去，而氨则与硫酸结合生成硫酸铵，存在溶液中： 消化时加入硫酸铜，是作催化剂，以加速分解反应： 2244242 2SOHCuSSOHCu 有机物消化完后，溶液具有清澈的硫酸铜的蓝绿
2、色，同时硫酸铜在下一步蒸馏时可作碱性反应的指示剂。加入硫酸钾，是为了提高溶液沸点，加速分解这一过程： 2242442 SOHSKHO在消化过程中，随着硫酸的不断分解，水分的不断蒸发，硫酸钾的浓度逐渐增大，沸点升高，加速了对有机物的分解作用。加入过氧化氢，是利用其氧化性，以加快反应速度：42423 222322 2242NN OHSCROHCS）（ ，蛋 白 质 （ 过 量 ）浓 硫 酸 OHOH22加 热 （2）蒸馏 硫酸铵在碱性条件下，释放出氨，通过加热蒸馏，氨随水蒸汽蒸出：（3）吸收和滴定 蒸馏出来的氨被硼酸溶液吸收，然后用硫酸标准溶液滴定生成的硼酸铵，属于盐类的滴定。硼酸为极弱的酸，在滴
3、定中并不影响所用指示剂的变色反应。根据硫酸溶液消耗的体积，计算总氮含量，再乘以蛋白质系数，即为粗蛋白质的含量。 342242742 7433 )(5)( BOHSNOHSOBNHB三、所用仪器及试剂药品：1、试剂：所有试剂均用不含氮的蒸馏水配制。（1）浓硫酸（2）硫酸钾（3）硫酸铜：（4）过氧化氢溶液：体积分数为 30。（5）硼酸溶液（30g/L）：取 30g 硼酸，溶解在 1L 水中。（6）甲基红溴甲酚绿混合指示剂：用体积分数为 95的乙醇，将溴甲酚绿及甲基红分别配成 1g/L 的乙醇溶液，使用时按 1g/L 溴甲酚绿：1g/L 甲基红为5：1 的比例混合，临用时混合。（7）标准滴定溶液：
4、硫酸标准溶液盐酸标准溶液（8）氢氧化钠溶液，质量比为 4001000。称取 400g 氢氧化钠，用 1000mL水溶解，待冷却后移入试剂瓶中。2、仪器：（1）凯氏烧瓶：500mL 或 250mL。（2）定氮蒸汽蒸馏器。（3）滴定管：25mL。（4）三角烧瓶：250mL。324242)( NHOSNaHOSN05242HSOCuLmolHc/05.1)(四、操作方法：（1）样品的称取精密称取 0202 00g 固体样品或 2005 00g 半固体样品或吸取100025 00mL（或用减量法称取 1215g）液体样品约相当于氮 3040mg，将样品和滤纸一起小心移入凯氏烧瓶的球部；液体样品要用减量
5、法于凯氏烧瓶中，倾倒样品时要顺着连烧杯一起称重的小玻璃棒小心操作，尽量使样品不挂在凯氏烧瓶的颈口部。（2）消化在凯氏烧瓶中加入 10g 硫酸钾和 1g 硫酸铜，量取 20mL 浓硫酸，徐徐加入到凯氏烧瓶中，混合，置于有石棉网的电炉上倾斜加热（通风橱内进行） 。一开始火要小，小心烧瓶内泡沫冲出而影响测定结果。当瓶内发泡停止，再加大火力，同时，分数次加入 10mL 过氧化氢溶液（加前须烧瓶冷却一会儿） ，冲下瓶颈和瓶壁上的炭化粒。当烧瓶内容物的颜色逐渐变成透明的淡绿色时，继续消化 0.51h。（3）转移使消化好的样品稍冷，沿瓶壁吹入少许水，混合，再逐渐沿瓶壁吹入少许水（防止剧烈沸腾，水迸出烧瓶）至
6、烧瓶内液体的体积约 60mL，沿玻璃棒将烧瓶壁内的液体倒入放有小漏斗的 100mL 容量瓶中，以水洗凯氏烧瓶三次，洗涤液沿玻璃棒倒入容量瓶中。冷却容量瓶，定容。（4）蒸馏（5）接好定氮装置(图 4-3-1) ，于水蒸气发生瓶中装入 2/3 以下的水，加入数图 4-3-1 定氮蒸馏装置1-电炉子 2-水蒸气发生器（平底烧瓶） 3-螺旋夹 4-小烧杯及棒状玻塞 5-反应室 6-反应室外层 7-橡皮管及螺旋夹 8-冷凝器 9-蒸馏液接收瓶粒玻璃珠防止暴沸，加热煮沸水蒸汽发生瓶内的水， 接通冷凝水。在接收瓶中加入 50mL30g/L 硼酸溶液和三滴混合指示剂，使冷凝器的出液端口位于接受瓶液面下。将 2
7、5mL 消化液小心移入定氮器的蒸馏瓶中，在缓慢加入 25mL400g/L氢氧化钠溶液，迅速塞好塞，用水分封好塞，通入蒸汽进行蒸馏。待接收瓶内液体约为 150mL 时，稍移动接收瓶，使出液口位于液面之上， ；流出的蒸馏液沿瓶壁流下，至接受瓶内液体接近 200mL，用少量蒸馏水冲洗冷凝管的出液口，将冲洗液收集入接收瓶，拿开接收瓶，停止蒸馏。（6）用硫酸标准溶液滴定至灰红色。（7）空白实验在测定样品的同时，进行空白试验，即除不加样品外，其他过程和样品的测定一样。干燥的 100mL 或 500mL 定氮瓶中加入 0.2g 硫酸铜，3g 硫酸钾及20mL 硫酸，稍摇匀后于瓶口放一小漏斗，将瓶以 45斜支
8、于有小孔的石棉网上，小心加热，待内容物全部炭化，泡沫完全停止后，加强火力，并保持瓶内液体微沸，至液体呈蓝绿色澄清透明后，再继续加热 0.5h。取下放冷，小心加20mL 水，放冷后，移入 100mL 容量瓶中，并用少量水洗定氮瓶，洗液并入容量瓶中，再加水至刻度，混匀备用。同时做试剂空白试验。五、计算式中：X样品中蛋白质的含量，g100g（g 100mL） ；V1样品消耗硫酸或盐酸标准溶液的体积，mL；V2试剂空白消耗硫酸或盐酸标准溶液的体积， mL；C硫酸或盐酸标准溶液的浓度，molL；0.0141.00mL 硫酸 c(H+)=0.0500mol/L 或盐酸 c(H+)=0.1000mol/L标
9、准溶液中相当的氮的质量，g；m样品的质量（或体积） ，g（或 mL） ； ）（ 1021002541 FmcV （4-3-1）F氮换算为蛋白质的系数。一般食物为 625；乳制品为638；面粉为 570；玉米、高梁为 624；花生为 546；米为 595；大豆及其制品为 571；肉与肉制品为 625；大麦、小米、燕麦、裸麦 为 583。六、注意事项1、加入样品及试剂时，避免粘附在瓶颈上。2、加入硫酸钾的作用：提高硫酸的沸点（338） ，增进反应速度。10g 硫酸钾将硫酸沸点提高到 400,但过多的硫酸钾会造成沸点太高。生成的硫酸铵在513会分解，故此加入 10g 硫酸钾量一定要准确。3、加入硫酸铜的作用：催化剂，使氧化作用加速。4、蒸馏时要注意蒸馏情况，避免瓶中的液体发泡冲出，进入接收瓶，避免火力太弱，蒸馏瓶内压力降低，接收瓶内液体倒流，造成实验失败。
