1、基金项目： 重庆市基本科研业务费资助项目 (16420) 重庆市 农发资金项目（ 17413） 作者简介 唐红梅（ 1986-） , 女 （汉） ， 研究实习员 ，硕士 , 主要研究方向兽药的分析检测及质量标准建立 ，联系电话 ： 15823431635， E-mail： *通讯作者 陈诚， 助理研究员， E-mail： 。 新型 盐 酸 头孢噻呋 乳 液 制备及 含量 测试 方法建立 唐红梅，陈诚 * （ 重庆市畜牧科学院，重庆 402460） 摘要： 以吐温 -80、斯盘 -85 为乳化剂，通过表面活性剂复配方法 制备了 新型 盐酸头孢噻呋 乳液制剂， 对制剂稳定性、粒径 进行了表征 ，
2、 并 建立了新型制剂头孢噻呋乳液 含量测定 HPLC法。 结果表明，制备的盐酸头孢噻呋乳液制剂分散均匀， 平均粒径 0.197 m，粒径分布在0.126-0.911 m。 采用反相高效液相色谱 法 ，色谱柱为 Sepax HP-C18(4.6mm250mm， 5m)，流动相 A：流动相 B（ 40： 60）为混合 流动相，流速 0.8 mL/min，检测波长 290 nm，进样体积 20L，柱温为 25 ，测得 3 批 盐酸 头孢噻呋乳液中 盐酸 头孢噻呋的含量分别为标示量的 102.5%、 105.4%、 95.0%， 在 2.4480.0g/mL 范围 内线性关系良好 (R2=0.9996
3、)， 平均 加样 回收率分别为 98.4%、 98.9%、 97.1%， RSD 分别为 1.94%、 1.41%、 0.83%。 关键词： 盐酸头孢噻呋； 乳液 ； 含量测定 中图分类号 ： TQ469 Preparation of New Cefuroxime Hydrochloride Emulsion and Determination of Content Hong-mei Tang， Chen Cheng* （ Chongqing Academy of Animal Sciences, Chongqing 402460） Abstract： Tween-80、 Span-85 as
4、 emulsifier， through the surfactant complex was prepared by emulsion formulation of ceftiofur hydrochloride which formulation stability、 particle size were characterized.ToestablishanHPLCmethod for determination theceftiofur hydrochloride content ofthe new type of ceftiazurin emulsion. The results s
5、howed that ceftiofur hydrochloride prepared uniformly dispersed emulsion formulations， the average particle size of 0.197m， the particle size distribution in 0.126-0.911m.The samples were separated on SepaxHP-C18(4.6mm250mm,5m)column, themixed mobile phase was considered ofmobile phase A :mobile pha
6、se B(40:60), flow rate is 0.8 mL/min and the detection wavelength set at 290 nm, Sample volume is 20L, column temperature is 25 .Results showedthat ceftiofur content of three ceftiazurin emulsion were 102.5% 、 105.4% 、 95.0%ofthe labelled quantitative respectively .Thelinearrangeofceftiofurwas 2.448
7、0.0g/mL(R2=0.9996), the averagerecovery 在此处键入 were98.4%、 98.9% and 97.1%, and RSD were1.94%、 1.41%、 0.83% (n =3)respectively . Key words: Ceftiofur hydrochloride;Emulsion;Determination of content 盐酸 头孢噻呋又名赛得福， 是美国法玛西亚普强公司创制的第一个畜禽专用的头孢菌素类抗生素 ， 1984 年 Labeeuw B 等首先 在实验室完成其 半合成， 其 在油 、 水中不溶，在丙酮中微溶，在乙醇中
8、几乎不溶。目前主要被制成头孢噻呋钠冻干粉以及盐酸头孢噻呋混悬液经皮下、乳房灌注或肌肉注射注射使用。但是，由于头孢噻呋钠冻干粉制剂在水中不稳定容易分解， 在 1530 条件下仅可保存12h， 不耐贮藏 ， 在动物体内达峰时间短，半衰期短，抑菌时间不长 ；而盐酸头孢噻呋混悬液存在颗粒大，肌肉注射刺激性大，动物耐受性不强等 不足 1-3。 本课题研发的 新型 盐酸 头孢噻呋 非水 乳液 不仅 粒径小 、 分散均匀， 而且 有效解决了盐酸头孢噻呋在水中 易 降解 、动物注射耐受性不好等问题 ， 延长药物在体内的有效作用时间，减少用药次数， 提高药物的组织选择性。 为了对该 新 型制剂进行科学合理的 质
9、量 品质控制， 本文 对制剂稳定性、粒径进行了表征 ， 并 建立了新型制剂头孢噻呋乳液含量测定 HPLC 法 ，此方法简便快捷， 线性良好， 重现性好，结果准确可靠，可用于头孢噻呋 乳 液 中头孢噻呋 的 含量 控制。 1、 材料与方法 1.1 仪器与试剂 Winner2308C 激光粒度仪，济南微颗粒仪器股份有限公司； SUl510 扫描电子显微镜，日本 Hitachi 公司； Agilent 1260 型液相色谱仪 （ UV-230 紫 外 -可见检测器和 EC2000 色谱工作站 ） ； 盐酸 头孢噻呋对照品 (中国兽医药品监察所 ， 批号 C11065020)； 盐酸 头孢噻呋乳液 (
10、重庆市畜牧科学院兽医兽药所，规格 5%，批号 170620-1、 170620-2、170620-3)； 其他试剂均为分析纯 。 1.2 盐酸头孢噻呋乳液制备 称取 盐酸头孢噻呋 5.00 g，吐温 -80 4.50 g， 斯盘 -85 2.60 g 于烧杯中，然后加入 二甲基 甲酰胺 40 mL， 加热至 80 ， 在 磁力搅拌器 3000 转 /min 搅拌 20 分钟 后 缓慢加入 60 mL、 80 的大豆油，继续 搅拌 20 分钟 ， 然 后 将制成 的乳液 通过 高剪切 匀质机 10000 转 /min，剪切 5 min，最后经 3KGY 的 60Co- Y 射线辐照灭菌，制成 新
11、型 盐酸头孢噻呋 非水 乳液。 生产 批号 （ 170620-1、 170620-2、 170620-3） 在此处键入 1.3 性能测试 乳液稳定性 试验 以 2015 版兽药典中对乳液稳定性检测方法进行检验 ， 试验方法如下：以半径为 10 cm的离心机每分钟 4000 转的转速离心 15 分钟，不应有分层现象。如有分层，记录分出 相 体积，以分出 相 体积最小为佳。 粒度 分析 采用 Winner2308C 激光粒度仪 测试盐酸头孢噻呋乳液粒径 4-6。 1.4 含量 检测 方法 1.4.1 色谱条件与系统适用性试验 色谱柱为 反相 SepaxHP-C18(4.6mm250mm， 5m)。
12、 流动相 A： 甲醇 ； 流动相 B： 取乙酸铵 3.9g， 20%四丁基氢氧化铵溶液 35.0mL，加水至 700mL，超声溶解，用冰醋酸调节 PH 至 6.06.3，加四氢呋喃 60mL。以 流动相 A： 流动相 B（ 40： 60）为流动相 。 流速 0.8mL/min， 检测波长 290 nm， 进样体积 20 L， 柱温为 25 。上述条件下 ， 盐酸 头孢噻呋与其他物质基线分离良好 ，分离度达到1.5 以上， 理论塔板 数大于 6000。 1.4.2 对照品溶液的制备 取 盐酸 头孢噻呋对照品约 25 mg， 精密称定 ， 置 50mL 量瓶中 ， 加 0.05mol/L乙酸铵 溶
13、液 20mL，超声溶解，以 0.05mol/L 乙酸铵溶液定容至刻度，得到0.5mg/mL 的对照品储备液 ， -20冰箱内保存 ， 备用。 1.4.3 供试品溶液的制备 取本品 0.2g， 置 20mL 容量瓶中 ， 加入 0.05mol/L 乙酸铵溶液 10mL， 摇匀，超声处理 15min， 定容 摇匀，滤过，取续滤液，过 0.45 m滤 膜，得供 试品溶液，备用待测。 1.4.4 测定方法 按“ 1.4.1”中试验条件进样 ， 以 保留时间定性 ， 以峰面积定量 ， 用外标法计算样品中 盐酸 头孢噻呋的含量 。 2、 结果与分析 2.1 性能测试 2.1.1 稳定性 试验 三批次头孢噻
14、呋 乳液稳定性试验 在 半径为 10 cm的离心机每分钟 4000 转的转速离心 15 分钟 后 均未 分层 ，符合 2015 版 兽药典要求 。 在此处键入 2.1.2 粒径分析 通过 Winner2308C 激光粒度仪 对盐酸头孢噻呋乳液进行粒径测试，其结果见图 1。由图 1 可知，盐酸头孢噻呋乳液分散均匀，平均粒径 0.197 m，粒径分布在 0.126-0.911 m，远低于 2015 兽药典注射液要求的 15 m粒径标准，具有较小 的肌肉注射刺激性以及更好的耐受性。 0 .0 0 .1 0 .2 0 .3 0 .4 0 .5 0 .6 0 .7 0 .8 0 .905101520频率
15、%粒径/ m图 1 盐酸头孢噻呋乳液粒径分析 Fig.1 Ceftiofur hydrochloride emulsion particle size analysis 2.2 方法学考察 2.2.1 专属性试验 按照“ 1.4.1”中 的 液相 色谱条件 ，以 0.48mg/mL 对照品溶液 ， 0.51mg/mL供试品溶液 ， 空白辅料溶液 以及流动相 分别 进样 20L， 采集 色谱 数据 ， 记录色谱图 。 结果发现 盐酸 头孢噻呋保留时间 约 为 9.5min， 空白辅料溶液在此波长条件下无吸收 ，故 对 盐酸 头孢噻呋出峰 无 干扰 ，流动 相中有机溶剂 在保留时间 3min左右
16、出现溶剂峰 ， 但与 盐酸 头孢噻呋峰相隔较远 ， 不影响 盐酸 头孢噻呋 的 出峰 。由此 说明该 分析 方法专属性强 ，乳 液中各种辅料对其含量的检测 无 干扰 ，因此该方法 可用于 盐酸 头孢噻呋乳液 中头孢噻呋的检测。 具体 液相色谱图见 下 图 1。 在此处键入 图 2 方法专属性考察色谱图 Fig.2 The specificity inspection of HPLCmethod 2.2.2 线性范围 精密移取对照品储备溶液 0.05、 0.1、 0.2、 1、 2、 5、 10mL，分别置于 10mL容量瓶中，用 0.05mol/L 乙酸铵溶液稀释至刻度。按 “1.4.1”中的
17、液相色谱条件 分别进样，记录色谱图，以峰面积 (y)对进样浓度 (x)进行线性回归，得到 盐酸 头孢噻呋 的线性回归方程 为 y=61004x-114.03，相关系数 R2=0.9996，表明样品在2.4g/mL480g/mL范围内线性良好，可用于含量检测 。 2.2.3 精密度考察 精密吸取 对照品储备溶液 适量，配制成 浓度为 0.096mg/mL 的 溶液 ， 按 “1.4.1”中 的色谱条件 进样 20L， 连续重复进样 6 次，记录 色谱 峰面积 ， 并计算相对标在此处键入 准偏差 (RSD)。 计算 RSD 为 1.07%， 表明仪器精密度良好， 可以 满足 实验 检测需要。 2.
18、2.4 重复性考察 取 同一批次 盐酸 头孢噻呋 乳液 ，按 “ 1.4.3”中的 条件平行制备 待测 盐酸 头孢噻呋供试品溶液 6 份， 按“ 1.4.1”中色谱条件操作进样 ， 测定 色谱 峰面积 ， 计算盐酸 头孢噻呋峰面积的 相对标准偏差 RSD。结果 RSD 为 0.93%， 表明 该方法重复性良好。 2.2.5 稳定性试验 取头孢噻呋乳液 ，按“ 1.4.3”中的条件制备成待测头孢噻呋供试品溶液，按“ 1.4.1”中色谱条件操作，分别在 0、 1、 2、 4、 6、 12、 24h 进样 ， 测定 色谱 峰面积 ， 计算 盐酸 头孢噻呋峰面积的 相对标准偏差 RSD。 RSD 为
19、1.39%， 表明 盐酸 头孢噻呋 乳液 在 24h 之内是稳定的 。 2.2.6 定量限和检测限 精密移取对照品储备溶液 适量 ，用 0.05mol/L乙酸铵溶液 逐级稀释 。按“ 1.4.1”中的液相色谱条件 进样 测定，记录色谱图。以信噪比 3： 1 为检测限， 以信噪比10： 1 为定量 限 。经过测定， 盐酸 头孢噻呋 的检测限和定量限分别是 0.075g/mL和 0.25g/mL。 2.2.7 加样回收 率 精密称 取 含量为 5%的 盐酸 头孢噻呋乳液 9 份 ，每份约 0.05g，平均分为 3组分别置于 100mL 容量瓶中， 分别准确加入相应量的头孢噻呋对照品 ， 按“ 1.
20、4.3”中的条件制备成待测 盐酸 头孢噻呋供试品溶液，按“ 1.4.1”中色谱条件操作，计算加样回收率及 相对标准偏差 RSD， 结果见 下 表 1。 由实验结果可知， 该方法结果准确可靠 。 表 1 盐酸 头孢噻呋回收率结果 (n=9) Table 1 Result of recovery for ceftiofur (sample size, n=9) 称样量 /g 样品含量/mg 加入量 /mg 测得量 /mg 回收率 /% 平均回收率 /% RSD/% 0.0263 1.3150 0.9662 2.2516 96.94 98.44 1.94 0.0242 1.2100 0.9662 2
21、.1823 100.63 在此处键入 0.0261 1.3050 0.9662 2.2496 97.76 0.0255 1.2750 1.2078 2.4718 99.09 98.88 1.41 0.0249 1.2450 1.2078 2.4212 97.38 0.0252 1.2600 1.2078 2.4699 100.17 0.0260 1.3000 1.4493 2.6988 96.52 97.11 0.83 0.0258 1.2900 1.4493 2.6923 96.76 0.0256 1.2800 1.4493 2.7012 98.06 2.2.8 样品 含量 测定 取批号为
22、170620-1、 170620-2、 170620-3 的 三 批 盐酸 头孢噻呋乳液 ， 分别按“ 1.4.3”中的条件制备成 3 份平行 待测供试品溶液 。 按“ 1.4.1”中色谱条件分别精密吸取质量浓度为 0.483mg/mL 的对照品溶液和供试品溶液 各 20L， 进样 ， 记录色谱图 ， 采用外标法 ， 以峰面积计算样品的含量 ，结果见下 表 2。 表 2 3 批 盐酸 头孢噻呋乳液含量检测结果 (n=3) Table 2Test results of 3 batches of ceftirothiazide emulsion (n=3) 批号 170620-1 170620-2
23、 170620-3 含量 (占标示量的百分数 )/% 103.2 104.8 95.6 101.9 105.2 94.6 102.4 106.2 94.7 平均值 /% 102.5 105.4 95.0 RSD/% 0.64 0.68 0.58 3、讨论 3.1 样品前处理方法的选择 破乳是指乳液完全被破坏 ， 发生 两相 分层现象 。 盐酸 头孢噻呋 非水乳液 需选择合适的提取溶剂来提取 盐酸 头孢噻呋 。 研究 发现，溶剂二甲基甲酰胺、甲醇、乙腈、 0.05mol/L 乙酸铵溶液 ，均可提取 盐酸 头孢噻呋 。通过 提取结果 对比，以0.05mol/L 乙酸铵溶液 提取 的 样品，样品相容
24、性良好，峰型对称，不拖尾前延 ，为最佳提取溶剂。同时比较不同的超声时间 15、 30、 45min 的区别 ，发现超声提取率相差不大，故为了节约时间，选择 超声提取 15min。 在此处键入 3.2 检测波长 及流动相 的选择 参考 2015 版中国兽药典 一部 及 国内外 文献， 对 盐酸 头孢噻呋对照品溶液进行全波长扫描 ， 由扫描 谱 图可知 ， 最大吸收波长为 290295nm，比较该段波长的各个色谱图，谱图最优为 290nm， 故样品的测定波长为 290nm7-10。比较甲醇、乙腈 及磷酸缓冲液等，最终优化发现由下面的配比流动相的色谱图对称性好，不拖尾。故 以流动相 A：流动相 B（
25、 40： 60）为 最佳 流动相 （ 流动相 A：甲醇；流动相 B：取乙酸铵 3.9g， 20%四丁基氢氧化铵溶液 35.0mL，加水至 700mL，超声溶解，用冰醋酸调节 PH 至 6.06.3，加四氢呋喃 60mL）。比较 流速 0.8 mL/min、1.0 mL/min、 1.2 mL/min 的色谱图，以流速 0.8 mL/min 为最佳 实验 条件。 本文 通过表面活性剂复配方法制备了 新型 盐酸头孢噻呋乳液制剂 ， 并 建立了新型制剂头孢噻呋乳液含量测定 HPLC 法 。 该 分析 方法准确、简便 、 重复性好，为控制 新型盐酸 头孢噻呋 乳液 产品 质量 、 确保产品批次间稳定性
26、 、 建立其质量标准 及为后续新药的研究 提供重要参考 ， 同时该方法可进一步 用于含相同药物的其他 制剂中 盐酸 头孢噻呋 的定性定量检测。 参考文献： 1王慧 , 陈 小军 , 刘伟 ,等 . 动物专用头孢噻呋 J. 动物医学进展 , 2009 , 30 (1) :104-108. 2郭腾 , 吴连勇 , 张家祥 ,等 . 兽用头孢类抗生素头孢噻呋研究进展 J. 畜牧与兽医 , 2003 , 35 (6) :38-41. 3Robb E J , Tucker C M , Rogers K C, et al. Efficacy of tulathromycin versus enroflox
27、acin for initial treatment of naturally occurring bovine respiratory disease in feeder calvesJ .Vet Ther, 2007, 8(2):127-135. 4蔡金华 , 顾欣 , 刘雅妮 , 等 . HPLC 法测定头孢噻呋钠原料含量 J. 中国兽药杂志 , 2007, 41(8):12-14. 5Hayes J R, English L L, Carter P J, et a1. E.coli resisitant to tllird-generationcephalosporins show d
28、ecreased cefquinome susceptibilityJ FDA Science, 2005, 11:27-28. 6常恩慧 , 宋瑞芝 , 周桂云 , 等 . 高效液相色谱法测定头孢噻呋钠含量 J. 中国兽药杂志 , 2007, 41(9):22-23, 37. 7国家药典委员会 . 中华人民共和国兽药典 一 部 M . 北京 :中国农业出版社 , 2015 8 昌莉丽 ,张春辉 ,肖传斌 ,等 . RP-HPLC 法测定头孢噻呋混悬注射液含量 J. 西北农业学报 , 2010 , 19 (6) :44-47. 在此处键入 9DavidF,Driscoll.Lipid inje
29、ctable emulsions :pharmacopeial and safety issuesJ.Pharmaceutical Research,2006,23(9):1959-1969. 10Oliver S P, Almeida R A, Gillesp IE B E. Extended ceftiofurtherapy for treatment ofexperimentally induced Strep tococcusuberis mastiffs in lactating dairy cattleJ.Journal of DairyScience, 2004,87(10):3322-3329.
