1、第一部分 开关机A A 、开机1.打开 UPS 电源，打开氮气发生器（气瓶） ，确认 Curtain gas 的输入压力为0.4MPa，gas1/2 为 0.7MPa，exhuast 为 0.4MPa。2.打开机械泵电源开关（5500 系列直接打开质谱主机电源，仪器自动启动机械泵）3.等机械泵工作至少 30min5.打开质谱主机电源开关6.过夜抽真空B B 、关机1.停止输液：关停针泵或液相泵，或断开输液管线（一般质谱主机 Standby 后液相系统也自动待机，输液泵自动关停，但建议操作人员再次确认，必须保证没有任何液体再泵入质谱）2.使仪器待机，并灭活配置2.关闭质谱仪主机电源开关（5500
2、 系列只需按下电源开关旁的 VENT 按键排放真空）3.机械泵继续工作至少 30min4.关闭机械泵上的电源开关（5500 系列会自动关停机械泵，待机械泵停止后即可关闭5500 系列主机上的电源开关）5.关闭气体发生器或气瓶第二部分 调谐1、PPG 就是正离子校正液，PPG3000 负离子调谐液，本台仪器只用两瓶校正液，正离子一瓶，负离子一瓶。洗液一瓶 50%的甲醇水。调谐前先用洗液洗针两次。吸校正液的时候慢慢吸，避免吸入气泡，吸好以后将针泵卡住。再将高度调到 5，将管路重新连接。不再连接六通阀，由质谱直接进样，且将针泵的速度调到 10L/ml。2、调谐液弄好后在仪器面板工具栏上：TOOl项目
3、创建项目。此项目为一个文件夹，文件夹里面包括所有此次采集的信息，方法、序列等，且所有采集的项目都固定在一个文件夹下面：D:/Analyst Data/Project。新建项目的时候，弹出窗口中有个 Add All，可以创建孙文件夹。3、联机：软件打开后在左上方硬件配置（单机选中，双击打开）只需选中仪器 MSactive profile。图标变为绿色，表示联机成功。调谐只需要选中质谱。仪器的实时状态可以点击右下方的图标，质谱和液相都是单独观察，质谱要注意真空度，为 0.5.4、调谐手动调谐项目（文件夹）选中下拉菜单中的 Installation 20161102（为系统默认的调谐文件夹），先 Q
4、1start syring pump（打开针泵）start（质谱），开始采集以后观察基线是否平衡，若等两分钟还未平衡好，则手动将针泵往上抬。5、平衡好后（基线平稳则为平衡好），重新进样，重新点击 start syring pump。Resolution（分辨率）advanced （高级选项）（看到结果后调节质量轴和分辨率做准备，只能先打开这个，再打开谱图）实时质谱图右键open file随便点一个框软件上方的从谱图校正 PPG.POS(正离子) start出现三行：（1、质量轴。2、分辨率。3、两次调谐的差异）若质量轴有差异右上角 yes 若分辨率飞离出虚线offset（偏大调大，偏小调小）输
5、入校正的数值，再重新进样，如此反复，直到点落在虚线以内，实线代表最合适。6、校正好后仪器会自动保存，直接关掉窗口即可。负离子调谐和正离子调谐步骤一样，只是在选择方法的时候要注意选择负离子模式。还有看结果时要选择 PPG3000.此为负离子调谐液。调谐因针泵流速很小，10L/ml，所以不需要设定离子源温度及辅助气，直接设定喷雾器流速为 50，就可以将样品雾化，气帘气也不需要设置，因为没有多余的溶剂需要吹走。第三部分：方法优化1.在 Analyst 软件 Tools 菜单中选择 ProjectCreate Project。在 Project name 项下输入新建的 Project 名称。注意，不
6、要点选窗口中的其他按钮！点击 OK，确认新建 Project。2.在 Analyst 软件界面下，双击导航栏内 Hardware Configuration。在弹出窗口中选择 MassOnly，点击 Activate Profile，激活 MassOnly（只联接质谱主机） 。3.在导航栏内单击 Tune and Calibrate，进入调谐模式。点击上方工具条中的 T钮。此时，应注意到主机有“扑” 声音，表明进入调谐状态。此时右下角质谱状态显示绿色。双击 Manual Tuning，进入质谱参数设置及运行窗口。4.使用 1mL 玻璃进样针吸取适当标准溶液，置于进样针座上。点击 MS Meth
7、od下拉菜单，选择 Syringe Pump Method，设定针泵流速 Flow Rate 为 10L/min。 5.点击 Start Syringe Pump 按钮开针泵进样。6.返回 MS Method，选择扫描模式 Scan Type 为 Q1 MS，设定扫描速度 Scan Rate 为 10Da/s，设定扫描范围 StartStop 设定为 50化合物分子量。DP预输入 60。7.点击 start 开始采集数据。运行稳定后，注意观察是否有预期的母离子出现，并控制其响应值在约 E4 以下。点击 stop，选择第一个峰（后面是同位素峰）的平稳段，双击，选中母离子。点击右键，选择 Dele
8、te Pane。8.设定 Scan type 为产物离子扫描 Product Ion（Ms2 ） ，扫描速度 200Da/s，选择扫描正/负离子，输入母离子（product of） ，设定扫描范围 startstop 为 50MW+20，覆盖可能的子离子质量范围，点击 compoud 标签，设定（DP）60， （CE）5。9.点击 start，开始采集数据，注意观察是否有预期的母离子出现。手动调节CE，以 5eV 为步长，逐渐增加。每次增加后稍作等待，直至目标化合物的子离子清晰看见。选择平稳的一段，双击，选择子离子。10.选择 Scan Type 为 MRM。设定参数表格中的 Q1 对应的母离
9、子，Q3 对应的子离子，time（ms）为 50，ID 值设为 名称 1（定量） ，名称 2（定性） 。11.点击 Edit Ramp，在 Parameter 下选择 Collision Energy，点击 OK。点击 start开始采集数据，记录每个 MRM 通道的最佳 CE 电压。在 MRM 参数设定表中，右键点击。选择 Collision Energy CE，调出表格中的 CE 列，输入每个 MRM 通道的最佳 CE 电压值，精确到个位数。重复以上步骤，在 Parameter 项下选择Declustering Potential，优化并保存 DP。完成后选择菜单 File/Save 保存
10、采样方法，文件名 .dam。 第四部分：方法建立一、LCMS 方法的建立：1、连接仪器：打开 HPLC 质谱电源，将 HPLC 系统接上柱子，将 6 号出口管线与离子源连好。调离子源喷雾针位置到 2mm 处，双击 Hardware Configure，在硬件配置菜单下单击 LCMS ( 液相与质谱联用 )， 单击Activate profile 激活仪器，会听到笛的一声，说明仪器已经连接上。 2、确认液质同步：选择项目（之前优化方法的时候已经建立的项目） ；双击 Build acquisition method 新建方法，弹出新建方法模板。在模板左侧点击acquisition method，模
11、板右边显示对应的参数，确认 synchronization mode 选择LC Sync,表示液质同步。3、设置 MRM 参数：点击方法模板左侧的 MRM, 在模板右侧 Scan Type下选择 MRM；在 polarity 下选择化合物极性：Positive (正离子)、Negative（负离子） ；Duration 为 15min(与液相分离 相同的时间)；表格中 Q1：母离子分子量，Q3(Da)： 子离子分子量，Time（msec）：50，ID 栏：化合物名称（离子对名称后空格加 1 为定量，空格加 2 为定性） ，在表格中右键分别单击 DP、 CE，点击工具栏的 OPEN 打开之前优化
12、的方法参数，调出 DP,CE 值，选中整行， Ctrl+c(复制 )参数，关闭窗口，再 Ctrl+v(粘贴)参数） ；最后点击Edit parameter 设置离子源参数：Source/Gas 项用以下推荐值：CUR 35，IS:5500(正离子) 或-4500（负离子） ，TEM 600，GS1 60，GS2 70，点击OK。4、设置液相参数：点击模板左边的 shimadzu LC system，在右边的pumps 栏下，设置 stop time （运行时间）为 15min， flow 流速为1mL/min，A 为水相设为 95%，B 为有机相设为 5%（设置时改 B，A 自动） ，泵最大压
13、力为 50；点击 time program 设置液相梯度：例咪唑类梯度设置：Time(min) A B- 95% 5%5 5% 95%10 5% 95%10.1 95% 5%15 95% 5%接着在右边的 Auto sampler 栏下，设置清洗时间，在 Rinse mode 下选择Before and after(前后都洗)，并设置清洗时间为 5s，清洗液用 50%甲醇水。最后点击保存按钮,在保存窗口输入该方法的名称。二、建立批处理：1、双击 Build acquisition batch，在右边窗口 set 栏为批处理保存的文件夹命名以便识别，再点击 add set，最后点击 add sa
14、mple，再选择之前建立的 LC-MS 方法，在弹出的窗口内的 number（进样样品数）处填入需要进样的样品个数，点击 OK。2、在加入的样品列表内依次填写 sample name（样品名称） 、via position（样品瓶的位置） 、inj.volunme（进样体积：一般 5 微升或 10 微升） 。3、在 submit 项下点击 submit 按钮以提交样品序列。4、点击工具条上左上角的 view queue 按钮 ，可查看已提交的样品。此时将仪器从校正状态退出，进入分析模式。确认泵已打开，首次进样液相先排气，再平衡仪器：先点击工具条上的 equilibrate 平衡按钮，在弹出的平
15、衡窗口中输入平衡时间 10min，点击 ok。右下角图标会变黄，待平衡结束后此处图标会变成绿色，此时即可点击 start sample 按钮采集样品信息，仪器会自动对已提交的全部样品进行采集。 第五部分 数据处理1. 双击打开 Multiquilt，选择项目，点击 File 下的 荧光棒型图标，点击sample，选择需要的标准品和样品数据，点击 next，create new method，为方法命名，点击 next，选择一个有代表性的样品（一般选择浓度较大的标品数据） ，设置分组（同一物质定量离子和定性离子设置为一组） ，并指定内标，next，对每个物质进行积分。2. 设置积分参数：a、 C
16、ausian Smoth（平滑）：一般是 0，如有毛刺可改成 1 或 2；b、 Expeceted Time（保留时间）:一般不动c、 Expected time 范围：一般 30s，表示在保留时间15s 范围d、 最小峰宽e、 最小峰高f、 背景噪音扣除：可调整目标峰基线以下被积分的面积，比例越高积分越往下，必要时调整。g、 分峰因子 ：峰有分叉时设置，如有两个分叉，设置为 2，峰分叉不能大于 2h、 单位：设置单位，勾选 Apply units to all 可将此单位用于所有化合物点击 next，点击 finish。在新跳出窗口内将标准品选定，输入浓度。查看各化合物积分是否正常，点击第三
17、个图标查看标准曲线。报告打印：点击 File，create report，Report template（选择报告模板，一般用 sample1 和标线，内标报告只能用 sample1,2,3） ，命名，选择存储报告位置，点 ok。信噪比：选择项目，双击 open date file，点击 sample，选择低浓度样品，点击 ok，点击XIC，选择定量离子，点击 ok，选中峰，按住 shift，选峰附近的一段时间，点Script，点击 S-ToNScript，即可得到结果。第六部分：LC-MS 离子阱原理及其应用原理：在进行多级质谱分析(MS-MS)时，首先限定目标质量的离子。通过调整交变电压，
18、将大于以及小于目标质量的离子射出，从而使得仅有一个质量的离子存在于离子阱中并将其富集。目标质量的范围被称为 Isolation Width。之后通过向离子阱内注入气体（通常为氦气或氮气） ，与离子发生碰撞使其被打成碎片。操作方法：首先在 Analyst 中打开一个成熟的 MRM 采样方法，然后右键单击Acquisition Method 中的 MRM，在弹出菜单中选择 Add IDA Criteria Level。在新增的 IDA-First Level Criteria 页面中设置相关逻辑选项（其中四项尤为重要）1) Select “X”to “Y” most intense peaks，表
19、示在多个组分色谱共流出时，指定触发最强的若干个母离子， “1 to 2”表示最强和次强的两个母离子，“1 to 3”表示最强和次强和第三位三个母离子，以此类推。请注意，如果选择了“1 to 2”或“1 to 3”，则后续的 EPI 个数应调整为对应的两个或三个。 （一般选择两个以下）2) After Dynamic Background Subtraction of Survey Scan，表示执行动态背景扣除，使得感兴趣的母离子都尽可能的获得触发 EPI 的机会。该选项尤为重要，为必选项。3) Exclude former target ions。在某些情况下，一次数据采集中，如果同一个 M
20、RM 通道内可能有几个不同保留时间的色谱法出现，那么应选择 Never，表示所有色谱法都依次触发执行 EPI。4) Which exceeds：设定 MRM 信号强度阈值超过此阈值才会触发 EPI。通常为 500 或 1000.然后点选 Include List 激活强制触发的母离子。Mass（Da ）列输入需要的母离子质量数，RT（min）列输入该母离子的保留时间，Width（sec）列输入开放的保留时间窗口。完成以上 IDA Criteria 逻辑选项设定后，添加 EPI 方法。首先，在 IDA Criteria 上点击右键，在弹出菜单中选择 Add experiment。软件会添加一个新
21、的 experiment，并自动与上一个 MRM 保持一致。然后在 Scan Type 处选择 Enhancde Product Ion（EPI） 。设定离子阱扫描速度 Scan Rate 为 10000Da/s（根据自动调谐的参数设定） 。在右侧表内设定二级质谱的扫描范围（应包含母离子及子离子） 。点击 Edit Parameters 按钮，进入此 EPI 对应的离子源和化合物电参数的设定窗口（将 CAD 模式改为 High，其余参数应与 MRM 保持一致） 。举例：设定 CE 为 35，CES 为 15，此处表示子离子扫描的碰撞能量为 20、35、50 三个值，即二级质谱为低中高三个碰撞能量所得的碎片离子混合图。最后选择菜单 File/Save 保存现有采样方法。
