1、实验四 大黄中游离蒽醌类成分的提取、分离与鉴定 一、概述植物来源：大黄系蓼科植物掌叶大黄(Rheum palmatum L)、唐古特大黄(Rheum tanguticum Maxim. ex Balf)或药用大黄(Rheum offcinale Baill)的干燥根及根茎。大黄记载于神农本草经等许多文献中，具有泻下、健胃、清热解毒等功效。自古以来，大黄在植物性泻下药中占有重要位置，是一味很早就被各国药典收载的世界性药材。功效：大黄具有多方面的生物活性，其抗菌、抗感染及抗肿瘤活性有效成分主要为蒽醌类衍生物，如：大黄酸、大黄素和芦荟大黄素；止血的主要有效成分为大黄酚；泻下的有效成分是结合型的蒽苷类
2、。蒽醌类衍生物占大黄总化学成分的 35，该类成分少部分以游离状态存在，大部分与葡萄糖结合成苷的形式存在。此外，大黄还含有鞣质等多元酚类化合物，含量在 10一 30之间，具止泻作用，与蒽苷的泻下作用恰恰相反。 主要化学成分的结构及物理性质 大黄中含有多种游离的羟基蒽醌及其与糖所形成的苷类化合物，已知的游离羟基蒽醌主要有以下 5 种化合物。大黄酸(rhein)，C 15H806，黄色针晶，m.p321322(330分解)，UV max431，258，231，204。可溶于碱水，微溶于乙醇、苯、三氯甲烷、乙醚和石油醚，不溶于水。大黄素(emodin)，C 15H1005，橙黄色针晶(乙醇)，m.p2
3、56257。UV max436，289，266，253，222。可溶于碱水，微溶于乙醚、三氯甲烷，不溶于水。芦荟大黄素(aloe emodin)，橙色针晶(甲苯)，m.p223224。UV max429，287，254，225，202。可溶于乙醚、苯及碱水，不溶于水。大黄素甲醚(physcion)，砖红色单斜针状结晶(苯)，m.p205207。溶于苯、三氯甲烷及甲苯，不溶于甲醇、乙醇、乙醚和丙酮，不溶于水。大黄酚(chrysophano1)，C 15H1004，橙黄色针晶(乙醇或苯)，m.p195196。UV max429，287，256，225，202。可溶于丙酮、三氯甲烷、苯、乙醚和冰醋酸
4、和碱水，微溶于石油醚，不溶于水。大黄酸葡萄糖苷(rhein 8-monoglucoside)，黄色针晶。m.p266267。大黄素葡萄糖苷(emodin monoglucoside)，橙色针晶(甲苯)。m.p190191。芦荟大黄素葡萄糖苷(aloeemodin monoglucoside)，黄色针晶。m.p235。大黄酚葡萄糖苷(chrysophanol monoglucoside)，橙色针晶(甲苯)。m.p239。二、实验部分(一)实验目的要求1掌握蒽醌苷元的提取方法双相酸水解法。2掌握梯度 PH 萃取法提取分离大黄中各种蒽醌苷元的原理及操作方法。3掌握羟基蒽醌类化合物的颜色反应及薄层色谱
5、鉴别方法。(二)实验的基本原理1提取原理双相酸水解法，为一相为与酸水不相互溶的有机溶剂，另一相为酸水，加热回流水解的方法。由于大黄中的羟基蒽醌类化合物多以苷的形式存在，所以首先要将苷水解成苷元，本实验选用硫酸和乙酸乙酯作为双相酸水解的溶剂，采用加热回流方法，提取大黄药材中的游离蒽醌类化合物。根据苷元不溶于水，可溶于乙醚、乙酸乙酯等亲脂性有机溶剂的性质，即在加热回流提取过程中，稀硫酸可将蒽醌苷水解成苷元，游离出来的蒽醌苷元随即溶于乙酸乙酯中，从而将蒽醌苷元提取出来。2分离原理pH 梯度萃取法 羟基蒽醌类化合物酸性强弱不同，用 pH 梯度法进行分离。具有羧基或多个 位酚羟基的蒽醌可溶于 5碳酸氢钠
6、溶液；具有一个 位酚羟基的蒽醌可溶于5碳酸钠溶液，只具有 位酚羟基的蒽醌，酸性弱，只溶于氢氧化钠溶液。以分离酸度不同的蒽醌苷元。也可利用游离蒽醌的极性不同，采用硅胶柱色谱法进行分离(1)大黄中游离蒽醌的酸性强弱顺序 大黄酸(COOH)大黄素( 酚OH)芦荟大黄素(醇OH)大黄素甲醚(OCH 3)大黄酚(CH 3)。(2)大黄中游离蒽醌的极性大小顺序 大黄酸大黄素芦荟大黄素大黄素甲醚大黄酚。大黄酚和大黄素甲醚酸性相近，但极性不同，可用硅胶柱色谱法进行分离。(三)实验方法1总蒽醌苷元的提取、分离工艺流程操作注意事项所得乙酸乙酯液中若带有酸水液，应用分液漏斗分出弃去；此处用蒸馏水洗除乙酸乙酯液中的酸
7、。萃取时容易发生乳化，而且随着碱液碱度的增高，乳化现象会越严重，所以要轻轻振摇。每次加碱液进行 pH 梯度萃取时，注意要测一下 乙酸乙酯液的 pH。萃取时一定要注意乳化层的分出，不要混入。2总蒽醌苷元的提取大黄粗粉 50g，置 500ml 烧瓶中，加 20硫酸溶液 100ml 和乙酸乙酯 250ml，水浴回流提取 2 个 h (加磁子搅拌)，放置，冷后过滤，残渣弃去， 乙酸乙酯提取液置分液漏斗中，分出酸水层，乙酸乙酯提取液用蒸馏水洗 2 次（每次 20ml），将乙酸乙酯液放置在锥形瓶中，密封。3.游离蒽醌的分离与精制(1)大黄酸的分离和精制将乙酸乙酯提取液置 500m1 分液漏斗中，用 5Na
8、HCO 3 溶液萃取三次（80ml, 60ml, 40ml） ，合并碱液，在搅拌下滴加浓盐酸，调节 ph2，放置，待沉淀析出完全后，过滤，并用少量水洗沉淀物至洗出液呈中性，60干燥，得深褐色粉末，主为大黄酸。沉淀干燥后，样品加冰醋酸 10ml 加热溶解，趁热过滤，滤液放置析晶，过滤，用少量冰醋酸淋洗结晶，得黄色针晶为大黄酸。(2)大黄素的分离和精制经 NaHCO3 溶液提取过的乙酸乙酯液，继用 5Na 2CO3 溶液萃取三次，每次用量40ml，合并碱液，在搅拌下滴加浓盐酸，调节 ph2，析出棕黄色沉淀，抽滤，水洗沉淀物至洗出液呈中性，60干燥，沉淀经干燥后，用 15ml 丙酮热溶，趁热过滤，滤
9、液静置，析出橙色针晶，过滤后，用少量丙酮淋洗结晶，得大黄素。(3) 芦荟大黄素，大黄素甲醚和大黄酚混合物的分离经 Na2CO3 提取过的乙酸乙酯液，再用 5NaOH 溶液提取三次，每次用量 40ml，合并后的碱液同（1）法处理，所得产品为黄色粉末，为芦荟大黄素、大黄酚和大黄素6甲醚的混合物。3.游离蒽醌类化合物的鉴定(1)化学鉴定 碱液试验 分别取各蒽醌结晶少许置于小试管中，加 lml 乙醇溶解，加 10氢氧化钠溶液数滴，观察颜色变化。羟基蒽醌类应呈红色。醋酸镁试验 分别取各蒽醌结晶少许置于小试管中，各加乙醇 lml 使溶解，滴加05醋酸镁乙醇溶液，观察颜色变化，羟基蒽醌应显橙色到蓝紫色。(2
10、)色谱鉴定薄层色谱鉴定吸附剂：硅胶 GCMCNa 板。 样 品：上述分别获得的大黄酸、大黄素、芦荟大黄素、大黄素甲醚和大黄酚的三 氯甲烷溶液及各相应对照品的三氯甲烷溶液。展开剂：石油醚乙酸乙酯醋酸(2：1：0.2)。展开方式：上行展开。显 色：在可见光下观察，记录黄色斑点出现的位置，然后用浓氨水熏或喷 5醋 酸镁甲醇溶液，斑点显红色。实验结果记录：观察斑点颜色，记录图谱并计算 Rf 值。四、注意事项大黄中蒽醌类化合物的种类、含量与大黄的品种、采集季节、炮制方法及贮存时间均有关系。由于蒽醌类衍生物主要以苷的形式存在，所以较新鲜的原药材蒽醌类成分含量高，如果是贮存时间长的饮片，则蒽醌类成分含量低，
11、实验选材要注意。用碱液萃取时要注意浓度和用量，酸化时，加酸要慢，多搅拌。分液漏斗的正确使用。五、思考题1简述液液萃取法的原理、溶剂选择原则和操作技术。2什么叫双相酸水解?掌握其原理和用途。3大黄中 5 种游离羟基蒽醌化合物的酸性和极性与结构有什么关系?4pH 梯度萃取法的原理是什么?该法适用于哪些中药成分的分离?5蒽醌类化合物及其甙的薄层色谱用什么作吸附剂、展开剂和显色剂?6. 蒽醌类与醋酸镁显色反应的必要条件是什么?其颜色反应与羟基所在的位置有何关系?参 考 文 献1杨其菖主编天然药物化学北京：中国医药科技出版社，1998，84-872李嘉蓉主编天然药物化学实验北京：中国医药科技出版社，2000，543陈德昌主编中药化学对照品工作手册北京：中国医药科技出版社，2000，42-46，974刘桂芳主编中药化学实验及技术沈阳：辽宁大学出版社，1995，205-213，2655阚毓铭等，中药化学实验操作技术，北京，中国医药科技出版社，1988，145 页6康延国 主编，中成药薄层色谱鉴别，北京，人民卫生出版社，1995，29 页
