1、16SrDNA 鉴定菌株的标准操作规程1. 适用范围本标准规定了通过特定引物对细菌的 16SrDNA 片段进行 PCR 扩增，然后对扩增片段进行序列分析比对，快速获得细菌种属信息的操作规程。本标准适用于未知细菌的快速种属分析，以及为细菌的生化鉴定提供指导信息。2. 方法和原理16SrDNA 鉴定是指用利用细菌 16SrDNA 序列测序的方法对细菌进行种属鉴定。包括细菌基因组 DNA 提取、16SrDNA 特异引物 PCR 扩增、扩增产物纯化、DNA 测序、序列比对等步骤。是一种快速获得细菌种属信息的方法。细菌 rRNA（核糖体 RNA）按沉降系数分为 3 种，分别为 5S、16S 和 23S
2、rRNA。16S rDNA 是细菌染色体上编码 16S rRNA 相对应的 DNA 序列。16S rDNA 由于大小适中，约 1.5Kb 左右，既能体现不同菌属之间的差异，又能利用测序技术较容易地得到其序列，故被细菌学家和分类学家接受。在 16S rRNA 分子中，可变区序列因细菌不同而异，恒定区序列基本保守，所以可利用恒定区序列设计引物，将 16S rDNA 片段扩增出来，利用可变区序列的差异来对不同菌属、菌种的细菌进行分类鉴定。16SrDNA 序列的前 500bp 序列变化较大，包含有丰富的细菌种属的特异性信息，所以对于绝大多数菌株来说，只需要第一对引物测前 500bp 序列即可鉴别出细菌
3、的菌属。针对科学论文发表或是前 500bp 无法鉴别的情况，需要进行16SrDNA 的全序列扩增和测序，得到较为全面的 16SrDNA 的序列信息。由于测序仪一次反应最多只能测出 700bp 的有效序列，为了结果的可靠性，通常将 16SrDNA 全长序列分成 3 部分进行测序。519R357F27F16SrDNA3 对引物正反向测通后，拼接成 1500bp 左右的 16SrDNA 序列。3. 设备和材料3.1 器材移液器（1000L、200L 、100L、10L）；涡旋振荡器；Eppendorf MixMate；离心机；水浴锅；电泳仪；制冰机；低温冰箱；PCR 仪：Veriti 96 Well
4、 Thermal Cycler； 凝胶成像仪：VersaDoc MP 4000；基因分析仪：AB3500、AB31303.2 试剂DNA 快速提取试剂：PrepMan Ultra；琼脂糖；PCR 试剂：Taq 酶，10Taq Buffer(Mg2+)，dNTPs，ddH 2O 等； ExoSAP-IT；测序试剂：BigDye Terminator， 5Sequencing Buffer；BigDye XTerminator Purification Kit；3.3 耗材移液器吸头：1000L、200L、10L ；离心管：1.5mL、200L；Micro AmpTM Optical 96-Wel
5、l Reaction Plate；Micro Amp TM Optical Adhesive Film；3.4 引物16SrDNA 名称 序列 扩增长度正向引物 27F 5-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3第 1 部分反向引物 519R 5- GWA TTA CCG CGG CKG CTG -3500 bp 左右正向引物357F 5- CTC CTA CGG GAG GCA GCA G-3第 2 部分反向引物1115R 5-AGG GTT GCG CTC GTT GC-3750bp 左右1115R1492R926F正向引物 926F 5- AAA CTY AAA KGA
6、 ATT GAC GG-3第 3 部分反向引物 1492R 5-TAC GGC TAC CTT GTT ACG ACT T-3560 bp 左右其中 M=C:A, Y=C:T. K=G:T, R=A:G, S=G:C. W=A:T; all 1:14. 操作流程5. 实验方法5.1 核酸提取：挑取单菌落，然后置于装有 100LPrepMan Ultra 的离心管中，涡旋震荡混匀 30s 左右，然后 100水浴 10min 后，以离心机最大转速离心 3min，取 10L上清液与 490L ddH2O（即稀释 50 倍），混匀作为下步 PCR 的模板 DNA。提取的 DNA 于-20保存。5.2
7、基因扩增5.2.1 PCR 反应体系试剂 使用量（25L 体系）模板 DNA 2L（10ng100ng）Taq 酶(5U/L) 0.2L10Taq Buffer(Mg2+) 2.5LdNTPs(各 2.5mM) 2L引物 F(1M) 5L引物 R(1M) 5LddH2O 8.3L核酸提取 基因扩增 序列比对产物纯化 测序反应备注：DNA 模板量通常在 100 ng 以下，必要时可进行梯度稀释，确定最佳的 DNA 模板使用量。PCR 反应体系应在冰中配置，然后置于冰箱中冷却 35min，最后放于 PCR 仪上进行反应，这种冷启动法可增强 PCR 扩增的特异性。5.2.2 PCR 反应条件94：1
8、0min94：30s58：30s72：45s72：5min 4：5.2.3 电泳称取 1g 琼脂糖置于 100mL TAE 电泳缓冲液中，加热融化，待温度降至60左右时，均匀铺板，制成 1%的琼脂糖凝胶。PCR 反应结束后，加样，以100V 电压进行琼脂糖凝胶电泳。电泳结束后，染色，用凝胶成像仪观察，拍照，记录实验结果。5.3 产物纯化5.3.1 每 5LPCR 产物加入 2L ExoSAP-IT 试剂，混匀。5.3.2 放入 PCR 仪中，37温育 15min, 80温育 15min。5.3.3 纯化后的 PCR 产物做为下一步测序反应的模板。5.4 测序反应5.4.1 测序反应体系30Cy
9、c试剂 使用量（10L 体系）模板 DNA 1L引物 (1M) 1.6LBigDye Terminator 1L5Sequencing Buffer 1LddH2O 5.4L5.4.2 测序反应条件96：2min96：30s55：15s60：4min 4：5.4.3 测序反应纯化(BigDye XTerminator Purification Kit)5.4.3.1 每管加入 27L SAM Solution 和 6L BigDye XTerminator Solution。5.4.3.2 放在 Eppendorf MixMate 上 2000rpm 震荡 30min。5.4.3.3 在离心机
10、上以 1000g 离心 2min。5.4.3.4 每管吸取 10L 上清液于 96 孔板中，放入测序仪中测序。5.5 序列比对基因测序仪得到的测序结果，在 MicroSEQ 微生物鉴定系统中进行比对，得到菌种的种属信息。6. 关键说明6.1 提取细菌基因组 DNA 时，对于细胞壁比较薄的革兰氏阴性细菌，可挑30Cyc取一菌环菌株，置于 100L ddH2O 中，混匀，沸水热变性 10min 后，离心 3min 分离，稀释 50 倍后做为 PCR 模板。必要时做梯度 PCR 确认最佳的模板量。6.2 PCR 及测序反应时，为了保证酶的活性，整个体系应在冰中配置；然后置于低温冰箱中冷却 35min
11、，最后放于 PCR 仪上进行反应，这种冷启动法可增强 PCR 扩增的特异性。6.3 16SrDNA 序列的前 500bp 序列变化较大，包含有丰富的细菌种属的特异性信息，所以对于绝大多数菌株来说，只需要第一对引物测前500bp 序列即可鉴别出细菌的菌属。针对科学论文发表或是前 500bp无法鉴别的情况，需要进行 16SrDNA 的全序列扩增和测序，得到较为全面的 16SrDNA 的序列信息。具体参照附录。PCR 出现非特异性条带的原因：一是引物与靶序列不完全互补、 或引物聚合形成二聚体。二是 Mg2+离子浓度过高、 退火温度过低，及PCR 循环次数过多有关。其次是酶的质和量，往往一些来源的酶易
12、出现非特异条带而另一来源的酶 则不出现，酶量过多有时也会出现非特异性扩增。其对策有：必要时重新设计引 物。减低酶量或调换另一来源的酶。降低引物量，适当增加模板量，减少循环次 数。适当提高退火温度或采用二温度点法(93变性， 65左右退火与延伸) 。PCR 扩增有时出现涂抹带或片状带或地毯样带。其原因往往由于酶量过多或酶的质量 差，dNTP 浓度过高，Mg2+浓度过高，退火温度过低，循环次数过多引起。其对策有：减少酶量，或调换另一来源的酶。减少 dNTP 的浓度。适当降低 Mg2+浓 度。增加模板量，减少循环次数。 用 RT 阴性对照检测是否被基因组 DNA 污染。模板浓度过高10ul 体系 1
13、00ngDNA附录（资料性附录）1. 细菌 16SrDNA 三部分的 PCR 结果电泳图M： DL2000；1：引物 27F 和 519R 的 PCR 产物（第 1 部分 500bp）2：引物 357F 和 1115R 的 PCR 产物（第 2 部分 750bp）3：引物 926F 和 1492R 的 PCR 产物（第 3 部分 560bp）M750bp1000bp100bp2000bp1 2 3500bp250bp2. 细菌 16SrDNA 鉴定结果2.1 16SrDNA 前 500bp 即可反映细菌的种属信息：菌株 TL140924 的鉴定结果2.2 16SrDNA 前 500bp 不足以反映细菌的种属信息：菌株 70528 的鉴定结果2.3 16SrDNA 的全序列信息：菌株 70528 的鉴定结果如附录 2.2、2.3 所示，当待测菌株的 16SrDNA 前 500bp 序列不足以将待测菌株与库中菌株区分时，则需要测其 16SrDNA 全长序列以将其区分。
