1、附录：常用试剂配制及应用一、常用缓冲液、试剂的配制碳酸盐缓冲液(Carbonate-Bicarbonate Buffer)由于碳酸盐 pH值偏碱，因此，常用于 pH9的缓冲液配制（附表 1）。附表 1. 0.2 mol/L碳酸盐缓冲液（pH9.210.7）pH0.2mol/L Na2CO3(ml)0.2mol/L NaHCO3 (ml)pH0.2mol/L Na2CO3(ml)0.2mol/L NaHCO3 (ml)9.2 4.0 46.0 10.0 27.5 22.59.3 7.5 42.5 10.1 30.0 20.09.4 9.5 40.5 10.2 33.0 17.09.5 13.0
2、37.0 10.3 35.5 14.59.6 16.0 34.0 10.4 38.5 11.59.7 19.5 30.5 10.5 40.5 9.59.8 22.0 28.0 10.6 42.5 7.59.9 25.0 25.0 10.7 45.0 5.0磷酸缓冲液(Phosphate Buffers，PB)磷酸盐是使用最广泛的一种缓冲剂，由于它们是二级解离，有二个 pKa 值，所以用它们配制的缓冲液，pH 范围最宽。NaH2PO4：pKa12.12，pKa27.21； Na 2HPO4：pKa17.21，pKa212.32。另外，磷酸盐还有钾盐分子形式，一般来说，低温时钠盐难溶，钾盐易溶，因
3、此，配制细胞培养用试剂时常常添加钾盐试剂，但若配制十二烷基硫酸钠（SDS）-聚丙烯酰胺凝胶电泳的缓冲液时，只能用钠盐而不能用钾盐，因为SDS会与磷酸钾生成难溶的十二烷基硫酸钾。磷酸缓冲液的优点为：可配制成不同离子强度的缓冲液；适用 pH缓冲范围较宽；受温度影响缓冲液 pH值变化较小；离子强度对缓冲液 pH影响较小，如 0.1mol/L缓冲液稀释 10倍其 pH变化小于 0.1。磷酸缓冲液的缺点是：磷酸盐易与钙离子（Ca 2+）、镁离子（Mg 2+）及重金属离子结合生成不溶的沉淀物；可能干扰某些生物化学反应过程，如对某些酶的催化活性具有一定程度的抑制作用。NaH2PO4的 pH值偏酸性，可用作
4、pH10的缓冲液。而 pH68 的中性缓冲液是更常用的缓冲液，需要 NaH2PO4与 Na2HPO4两种磷酸盐混合配制（附表 2）。附表 2. 0.2 mol/L磷酸盐缓冲液（pH5.78.2）pH0.2mol/L NaH2PO4(ml)0.2mol/L Na2H PO4 (ml)pH0.2mol/L NaH2PO4(ml)0.2mol/L Na2H PO4 (ml)5.7 93.5 6.5 7.0 39.0 61.05.8 92.0 8.0 7.1 33.0 67.05.9 90.0 10.0 7.2 28.0 72.06.0 87.7 12.3 7.3 23.0 77.06.1 85.0
5、15.0 7.4 19.0 81.06.2 81.5 18.5 7.5 16.0 84.06.3 77.5 22.5 7.6 13.0 87.06.4 73.5 26.5 7.7 10.5 89.56.5 68.5 31.5 7.8 8.5 91.56.6 62.5 37.5 7.9 7.0 93.06.7 56.5 43.5 8.0 5.3 94.76.8 51.0 49.0 8.1 4.2 95.86.9 45.0 55.0 8.2 3.0 97.0磷酸盐缓冲溶液（Phosphate-buffered saline, PBS)磷酸盐缓冲液是在磷酸缓冲液基础上添加 NaCl以维持溶液的渗透压
6、，因此，PBS适用于做细胞缓冲液，常用 PBS配制如下。NaCl 8gKCl 0.2gNa2HPO4 1.44gKH2PO4 0.24g在 800ml蒸馏水中溶解，用 HCl调节溶液的 pH值至 7.27.4 加水定容至1L，15psi（1.05kg/cm2）高压灭菌 20min，室温保存备用。Tris缓冲液（Tris-HCl Buffer, TB）Tris的 pH值偏于碱性，因此，通过添加 HCl调节 pH至所需值，Tris-HCl缓冲液的离子强度（mol/L）是专指 Tris的浓度，如某一特定 pH的 0.05 mol/L Tris缓冲液的配制是将 50ml 0.1 mol/L Tris碱
7、溶液与附表 3所示相应体积（ml）的 0.1 mol/L HCl混合，加水至将体积 100ml，即为 0.05 mol/L Tris缓冲液。另外，按附表 3制备的缓冲液，由于试剂来源的不同，缓冲液 pH可能与所需略有差异，此时可通过稍许减少或增加 HCl用量，精细调节 pH至所需值。附表 4. 0.05 mol/L Tris缓冲液pH 需 0.1 mol/L HCl（ml) pH 需 0.1 mol/L HCl（ml)7.1 45.7 8.1 26.27.2 44.7 8.2 22.97.3 43.4 8.3 19.17.4 42.0 8.4 17.27.5 40.3 8.5 14.77.6
8、38.5 8.6 12.47.7 36.6 8.7 10.37.8 34.5 8.8 8.57.9 32.0 8.9 7.08.0 29.2Tris盐缓冲液（TBS）：Tris盐缓冲液是在 Tris缓冲液基础上添加 NaCl以维持溶液的渗透压，因此，TBS 也适用于做细胞缓冲液，常用 TBS配制如下。8g NaCl、0.2g KCl 以及 3g Tris溶解于 800ml蒸馏水中，加入 0.015g酚红并用 HCl调 pH至 7.4用蒸馏水定容至 1L，分装后在 15psi（1.05kg/cm2）高压灭菌 20min，室温保存。现在常用 Tris盐缓冲液通常不加 pH指示剂，而且该溶液如果不用
9、于细胞培养，通常不加 KCl及酚红。Hanks液 (Hanks Balanced Salt Solution)Hanks液是一种平衡盐溶液，主要用于细胞培养取材时组织块的漂洗、细胞的漂洗等。贮存液 A液：(I)NaCl 80g KCl 4g MgSO47H2O 1gMgCl26H2O 1g用双蒸馏水定容至 450ml。(II)CaCl2 1.4g (或 CaCl22H2O 1.85g)用双蒸馏水定容至 50ml。将 I和 II液混合，即成 A液。贮存液 B液：Na2HPO412H2O 1.52g，KH2PO4 0.6g, 酚红 0.2g, 葡萄糖 10.0g,酚红应先置研钵内磨细，然后按配方顺
10、序一一溶解，用双蒸馏水定容至500ml。 (3)应用液：A、B 储存液分别经 112.6湿热灭菌 20min，取 A和 B液各25ml，加无菌双蒸馏水至 450ml，使用前用无菌的 3.5%或 5.6% NaHCO3调至所需 pH。注意：药品必须全部用 A.R试剂，并按配方顺序加入，用适量双蒸水溶解，待前一种药品完全溶解后再加入后一种药品，最后补足水到总量。无 Ca2+、Mg 2+ Hanks液（ Hanks Solution without calcium, magnesium sulfate）NaCl 80g, KCl 4g, Na2HPO412H2O 1.52g，KH2PO4 0.6g,
11、葡萄糖 10g,用双蒸馏水溶解后，加入 0.4酚红溶液 50ml，再加入双蒸水至1000ml，112.6湿热灭菌 20min，4 冰箱保存。临用前将原液用无菌双蒸水作 1：10 倍稀释，用无菌的 3.5%或 5.6% NaHCO3调至所需 pH。pH7.2柠檬酸盐缓冲液(Citrate Buffer)柠檬酸 0.327g柠檬酸钠 2.63g磷酸氢钠 0.222葡萄糖 0.00255mg蒸馏水加至 100ml。pH3.3枸橼酸-磷酸盐缓冲液（Citric acid- Phosphate Buffer)0.131mol/L citrate acid，0.066mol/L Na2HPO4，等量混合，
12、调节 pH至3.3。0.5 mol/L EDTA, pH 8.0EDTA2H2O 186.1 gNaOH 20 g将 EDTA2H2O加入 800ml水中，在磁力搅拌器上剧烈搅拌。用 NaOH调节pH至 8.0，EDTA 直到接近 pH 8.0才完全溶解，定容至 1L。分装后高压蒸汽灭菌。0.4%酚红溶液取酚红 0.4g置于研钵中逐滴加入 1mol/L NaOH溶液 11.28ml，边研磨边使酚红转变为钠盐溶于水中，加双蒸水至 100ml，过滤后，4 冰箱保存。醋酸钾（Potassium Acetate）在 60ml 5mol/L醋酸钾溶液中，加入 11.5ml冰醋酸和 28.5ml水。该溶液
13、用于碱性裂解。3mol/L 醋酸钠（Sodium Acetate），pH5.2 和 pH7.0在 800ml水中溶解 408.1g三水醋酸钠，用冰乙酸调 pH至 5.2或用稀释乙酸调 pH至 7.0，加双蒸水至 1L。分装后高压灭菌。柠檬酸钠缓冲液(Sodium Citrate Buffer)柠檬酸钠 1.8gHCl(1mol) 4ml无水乙醇 95ml先用 100ml去离子水溶解柠檬酸钠，然后加入 HCl和无水乙醇，再补充去离子水至总量 200ml。饱合硫酸铵溶液(Saturated Ammonium Sulfate Solution)取 500ml双蒸馏水，加入约 400克硫酸铵，水浴加热
14、至 70，磁力搅拌器充分搅拌，直到加入的硫酸铵不再溶解，以氨水（也可用 NaOH）调 pH7.2，室温保存。二、酶免疫检测常用试剂配制包被液(Coating Buffer)（pH9.5 碳酸盐缓冲液）Na2CO310H2O 8.58g NaHCO3 5.8g 溶于双蒸水至 1000ml。封闭液(Confining liquid)（5%脱脂乳-PBS 溶液，pH7.4）脱脂乳 50g加 0.02mol/L pH7.4磷酸盐缓冲液（PBS）至 1000ml溶解。洗液(washing liquid)氯化钠 8.0g磷酸二氢钾 0.2g磷酸氢二钠（12H 2O） 2.9g吐温-20 0.5ml加去离子
15、水至 1000ml溶解即可。终止液(stop buffer)（2mol/L H 2SO4）：21.7ml H2SO4 加去离子水至 200ml。缓冲甘油(glycerine buffer)甘油 9 份PB（pH8.0） 1 份 将 9份甘油与 1份 PB合并，充分混匀。0.5%H2O2-甲醇液(Hydrogen Peroxide-Methanol Solution)（总体积 120ml）3%H2O2 20ml甲醇 100mlDAB-H2O2底物缓冲液(DAB- H 2O2 Substrate Buffer)取 6mg二氨基联苯胺(3,3-Diaminobenzidine Tetrahydroc
16、hloride DAB)溶解于 10ml 0.05mol Tris-HCl pH7.6。使用前取 0.3%H2O2 0.1ml加入到 DAB溶液中(H 2O2的终浓度为 0.003%)。如有沉淀生成，则用滤纸过滤。5-溴-4-氯-3 吲哚磷酸/四唑氮蓝底物显色液（BCIP/NBT Substrate Solution）贮存液配制：NBT：在 10ml 70%的乙醇中溶解 0.5g NBT。BCIP：在 10ml 100%二甲基甲酰胺中溶解 0.5g BCIP。贮存液 4保存，可稳定一年。底物显色液：取 66l NBT贮液与 33l BCIP加入到 10ml碱性磷酸酶缓冲液中，充分混匀，底物显色
17、液应在用前 1小时内配制。三、细胞相关试剂配制L-谷氨酰胺（L-G）溶液（L-glutamin Solution）（0.2 mol/L）称 2.9 g L-谷氨酰胺（分子量为 146.15）用去离子水溶解至 100 ml，过滤除菌，分装小瓶，45 ml/瓶，-20冻存。100x青-链霉素（双抗）溶液（P/S Penicillin/Streptomycin Solution）取青霉素 G（钠盐）100 万单位和链霉素（硫酸盐）1 g，溶于 100 ml去离子水中，分装小瓶，45 ml/瓶，-20冻存。7.5% NaHCO3溶液（NaHCO 3 Solution）称分析纯 NaHCO3 7.5 g
18、，用去离子水溶解至 l00ml，过滤除菌，分装小瓶，45 m1/瓶，盖紧瓶塞，4保存。HEPES溶液（HEPES Solution） （1mol/L）称 23.83 g HEPES（N-2-Hydroxyethylpiperazine-N-2-ethanesulfonic acid，N-2-羟乙基呱嗪-N-2-乙基磺酸，分子量为 238.3） ，用去离子水溶解至100 ml，过滤除菌，分装小瓶，45 m1/瓶，4保存。氨基喋呤（A）贮存液（Aminopterin Stocking Solution）（100, 410-5 mol/L）称 1.76 mg氨基喋呤（ Aminopterin, 分子
19、量 440.4） ，溶于 90 m1去离子水中，滴加 l mol/L NaOH 0.5 m1，并不断搅动，待氨基喋呤完全溶解后，加 1 mol/L的 HCl 0.5m1中和，再补加去离子水至 100 m1。过滤除菌，分装小瓶，2 ml/瓶，-20冻存。次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷贮存液（HT Stocking Solution）（100,H: 10-2 mol/L; T: 1.610-3 mol/L）称取 136.l mg次黄嘌呤（Hypoxanthine，分子量 136.1）和 38.8 mg胸腺嘧啶核苷（Thymidine，分子量 242.2） ，加去离子水至 l00 ml，置 4550水浴中使
20、完全溶解，过滤除菌，分装小瓶，2 m1/瓶，-20冻存。用前可置 37加温助溶。HAT培养液培养液 98 ml，A 贮存液 1 m1，HT 贮存液 l ml。秋水仙素溶液（colchicine Solution）称取 10 mg秋水仙素，溶于 100 m1生理盐水中（即为 100 g/ml） ，过滤除菌后，分装小瓶，20冻存备用。Alsevers血细胞保存液（Alsevers Solution）葡萄糖 2.05g, 柠橡酸钠 0.8g, NaCl 0.42g，蒸馏水 l00ml。以上成分混匀后，微加温使其溶解后，用柠檬酸调节 pH 6.1，分装于三角瓶中(3050ml/瓶), 113湿热灭菌
21、15min，4保存备用。细胞冻存液(Freezing Medium)50%小牛血清；40%不完全培养液；10%DMSO（二甲基亚砜）。0.025%胰蛋白酶0.2%EDTA 细胞消化液(Trypsin-EDTA Solution)A: 2.5%胰蛋白酶:胰蛋白酶 2.5g磷酸缓冲盐溶液 100ml过滤除菌保存。B: 0.2%二乙胺四乙酸二钠（EDTA）EDTA 0.2g双蒸馏水 100ml高压灭菌保存。取 A液 1份，加 B液 99份，混匀，分装-20保存。0.83% NH4CI溶液(Ammonium Chloride Solution)NH4CI 0.83gKHCO3 0.1gEDTA2Na
22、0.0037g蒸馏水加至 100ml。Tris-NH4Cl溶液(Tris-Ammonium Chloride Solution)NH4Cl 3.735g/450ml双蒸水+Tris 1.3g/50ml 双蒸水（pH 7.65） 。细胞裂解液（Cell Lysis Solution）20mmol/L HEPES(pH 7.5)150mmol/L NaCl1 mmol/L EDTA10g/ml leupeptin1mmol/L PMSF1% Triton X-1000.5% deoxicholate (sodium salt)0.1% SDS组织匀浆缓冲液（Histolysis Buffer）50
23、mmol/L Tris-HCl (pH7.5)150mmol/L NaCl 1% NP401mmol/L phenylmethylsulfonyl fluoride 4g/ml leupeptin1g/ml aprotinin细胞核裂解液(Nuclear Lysis Buffer)10mmol/L Tris-HCl (pH8.0)150mmol/L NaCl10mmol/L EDTA蛋白酶 K 100g/ml0.4%SDS（最后加）10mmol/L苯甲基磺酰氟（PMSF）在异丙醇中溶解 PMSF至 1.74mg/ml，即 10mmol/L，分装后保存于-20，如果需要的话，可将储存液制备至 1
24、7.4mg/ml，即 100mmol/L的高浓度。闪烁液(Scintillation Solution)PPO (2,5-二苯基) 5.0g、POPOP（1,4-双5苯基）0.5g 溶于 1000ml二甲苯中。也可将 POPOP加入二甲苯，在 37水浴上溶解后，再加 PPO，然后补足二甲苯。3H-TdR 工作液（woking Solution）按 1:20的比例将浓度为 1mCi/ml的 3HTdR 用无血清的 RPMI培养液稀释，终浓度为 50Ci/ml。肝素溶液的配制： 含有肝素的培养液可以使内皮细胞纯度提高，肝素加入全培养液中最终浓度为 50ug/ml。因为现在市售的多为肝素钠，包装为约为 0.56克/瓶，配制时，可将其溶于 100ml三蒸水中，定容，过夜，然后过滤除菌，分装小瓶，保存温度为 4 。使用时，向 100ml培养液中加入 1ml（精确可加入 0.9ml）即可。
