1、组织学光镜标本制作技术,人体解剖与组织胚胎学系 孟运莲 教授,一、组织学标本制作的意义和目的 二、组织学标本制作的方法 三、组织切片标本制作的基本程序 四、苏木精伊红染色的程序,一、组织学标本制作的意义和目的 组织学标本制作技术是随着生命科学的发展而不断进步的。利用组织切片和染色(staining)的方法所制出的标本显示了各种组织细胞的不同结构和形态，它们之间的相互连接及它们之中的某些化学成分的种类和含量的变化，为细胞分子学的研究提供了最直观的依据。因此，组织学标本制作技术是医学和生物学研究的一个最基本的手段。,二、组织学标本制作的方法,（一) 组织切片法 (二) 非组织切片法,(一) 组织切
2、片法 利用化学试剂将组织经过一系列的固定(fixation)、脱水、透明后，再利用石蜡或火棉胶和明胶等支持物渗透进组织内部，使组织保持一定的硬度，并包埋(embedding)成块，然后依靠切片机(microtome)将包埋好的组织块切成以微米计的薄片，再根据需要进行各种染色得到的供显微镜下观察的标本的方法。 有石蜡切片、火棉胶切片、明胶切片和冰冻切片等。,(二) 非组织切片法 有些软组织、硬组织或液态组织可以不经过切片而 制成 观察标本，如 涂片、压片、铺片、磨片、消化分离、活体标本、整装标本和血管注射标本等。, 涂片 将所采的血液或骨髓样品涂抹于载玻片上经瑞氏或姬姆萨染色后的标本。, 压片
3、先将组织处理成小块物质，然后经化学药品软化和染色，再用盖玻片压封于载玻片上的标本。例如运动终板等。, 铺片 将需要观察的薄片组织用手工的方法直接铺于载玻片上，然后经过固定、染色等程序制成的标本。例如蛙的肠系膜铺片，大白鼠的皮下组织铺片等。, 磨片 骨和牙齿等硬组织，不经脱钙和切片，直接在磨石上用手工磨成大约50微米左右的薄片，然后再进行染色封固在载玻片上的标本。, 消化分离 将组织分离成小块，然后将其细胞间质消化溶解，再用机械分离的方法，如利用水的震荡冲击力等，使小块组织分离成单个而又完整的细胞，经染色后涂于载玻片上封固。例如平滑肌分离标本，脊髓的运动神经细胞等。, 活体标本 将所采的观察标本
4、加生理盐水后直接滴于载玻片上在显微镜下观察。 整装标本 一种是将胚胎或小动物经前期固定后整体封藏于盛满固定剂的透明容器中。另一种是将发育至某一阶段的鸡胚整体取出，经固定、染色、脱水和透明后封固于载玻片上的标本。 血管注射标本 一种是将有色物质注射进血管，用酸或硷将血管周围的组织腐蚀后做成的整体封藏的血管标本。 另一种是将有色物质注射进血管后，经一系列制片技术处理后封固于载玻片上供显微镜下观察的标本。,三 、石蜡切片标本制作的基本程序 取材固定固定后处理脱水透明 包埋切片染色封固,（一）取材 动物的处死 处死动物要求手法迅速、快捷，避免动物因过度痛苦而产生组织细胞的变化。 处死动物的几种常用方法
5、：麻醉法、空气栓塞法、击头法、颈椎脱臼法、破坏脑和脊髓和股动脉放血。 选择动物 取材应根据实验工作的目的选择动物的种类，如猪的肝、猫的卵巢、狗的胃等；制作运动终板可用爬虫类动物如壁虎；观察间皮和内皮用蛙的肠系膜。 选择取材部位 如肥大细胞可取皮下组织；胰腺取胰尾部，脊髓的运动神经元取颈膨大和腰膨大处，肺取肺门，胃取胃底部, 选择切面方向 根据器官组织的结构特点选择切面方向，如肾脏宜在肾门处作纵切，头皮应顺毛根的方向纵切，大小肠的环行皱襞应纵切，气管和食管作横切比较适宜。 应注意的问题 组织新鲜 注意环境温度的影响 材料应小而薄 1515 05厘米 防止组织变形 防止组织损害 防止组织污染,（二
6、）固定, 固定的目的 防止组织细胞产生自溶和腐败 使细胞易于着色 使组织适度硬化, 固定的方法 直接固定 蒸汽固定 灌注固定 局部灌注固定 全身灌注固定, 局部灌注固定 肾脏和肝脏可从其动脉注入固定液，同时剪断其静脉以利血液流出。眼球可从眼后房注入固定液。肺脏可从气管或支气管注入固定液。脑组织从颈动脉朝向头部方向进针注入固定液，同时剪开对侧颈静脉或左心房以利血液流出。经局部灌注固定的器官取下后应投入相同的固定液中进行后固定。 全身灌注固定 较大的动物例如猫和狗等可采用全身输液的方法进行固定，方法是：动物经前期麻醉后，从一侧股动脉输入固定液，剪开另一侧股静脉以利血液流出，直至流出液为固定液时为止
7、，动物灌注固定后取下的组织应用相同的固定液进行后固定1224小时。 较小的动物如大白鼠和小白鼠等，用10%水合氯醛腹腔麻醉（亦可用乙醚吸入麻醉）后手术暴露心脏，剪开心包膜，在主动脉弓下穿进一根纱线备用，从左心室向主动脉弓方向进针，随即用穿好的纱线固定针头，剪开右心耳放血，先注入生理盐水，观察右心耳流出的液体成无色时，即可换成4%多聚甲醛溶液（用01MPB配制），约30分钟后停止。取下组织用4%多聚甲醛溶液后固定1224小时。, 固定的注意事项 固定剂的用量 一般为组织块体积的15倍左右。 固定剂的配制 现配现用最为理想。 固定的时间 一般情况下固定24小时既可达到固 定要求。, 固定后处理,流
8、水冲洗 脱黄 脱汞 脱甲醛色素 组织漂白 脱钙（酸溶液脱钙 、螯合脱钙 、电解脱钙 ）, 固定剂单纯固定剂 甲醛、乙醇、冰乙酸、升汞、苦味酸、 重铬酸钾、丙酮、 铬酸、四氧化锇 混合固定剂 中性甲醛液、乙醇甲醛液、 Bouin氏液、 苦味酸硫酸液 、Carnoy氏液 、Helly氏液,甲醛(Formeldedhyde)固定浓度： 4%水溶液（10 %福尔马林）固定时间： 12小时24小时固定后处理： 流水冲洗12小时24小时配制方法： 甲醛原液10ml 生理盐水（或蒸溜水）90ml 特性： 甲醛原液浓度为40%。甲醛放置时间过长易产生白色沉淀“三聚甲醛”，氧化后变为甲酸，使溶液变为酸性，严重时可影响到细胞核着色。因此需长期保存的甲醛溶液应加入适量的碳酸镁或碳酸钙作为中和剂。酸性甲醛固定的组织易产生甲醛色素，固定后须用硷性溶液洗涤。,
