1、1,不明原因肺炎病例的实验室诊断,广州市第八人民医院检验科卢业成,2,主 要 内 容,不明原因肺炎的病原学实验室生物安全标本的采集、包装、运送及保存不明原因肺炎的实验室检测注意事项,3,一、不明原因肺炎的病原学,肺炎,细菌性肺炎：肺炎链球菌、克雷伯菌、葡萄球菌、 ,Atypical pneumonias支原体肺炎衣原体肺炎军团菌肺炎 ,非感染性肺炎：过敏性肺炎、肺血管炎、急性间质性肺炎,有流感症状的疾病：普通感冒、流感、艾滋病、免疫抑制合并肺部感染,其他传染性肺炎：炭疽、肺鼠疫,不明原因肺炎,SARS,高致病性人禽流感,4,SARS的病原学,SARS-CoV属冠状病毒科冠状病毒属的有包膜病毒。
2、病毒基因组为单股正链RNA，30,000个核苷酸组成；与经典冠状病毒仅有约60%同源性，但其组织形式与其他冠状病毒相似。双层脂膜，外膜蛋白包括糖蛋白S、M和小衣壳E蛋白。M糖蛋白仅有短的氨基末端结构域暴露于包膜外面；长而弯曲的羧基末端与单一分子的基因组RNA及多分子的碱性N蛋白组成螺旋状核衣壳结构。,5,SARS-CoV的生物学特性：,室温下在尿液里至少可存活10天，在腹泻患者的痰液和粪便里能存活5天以上，在血液中可存活约15天，在塑料/玻璃/马赛克/金属/布料/复印纸等物体表面可存活23天。病毒对温度敏感，随温度升高抵抗力下降，37可存活4天，56加热90min、75加热30min能够灭活病
3、毒。紫外线照射60min可杀死病毒。病毒对有机溶剂敏感，乙醚4 条件下作用24小时可完全灭活病毒，75%乙醇作用5分钟可使病毒失去活力，含氯的消毒剂作用5分钟可以灭活病毒。,6,*属正粘病毒科甲型流感病毒属。呈多形性，有囊膜。*病毒基因组为分节段单股负链RNA。*能感染人的亚型有H5N1、H9N2、H7N7、H7N2、H7N3等，其中感染H5N1的患者病情重，病死率高。,禽流感病毒结构示意图,7,禽流感病毒的生物学特性：,对乙醚、氯仿、丙酮等有机溶剂敏感。常用消毒剂易将其灭活，如氧化剂、稀酸、卤素化合物（漂白粉和碘剂）等能迅速破坏其活性。对热比较敏感，但对低温抵抗力较强，65 30min或煮沸
4、2min可灭活。在较低温粪便中可存活1周，在4水中可存活1个月，对酸性环境有一定抵抗力，在pH4.0也具有一定存活能力。在有甘油存在的情况下可保持活力1年以上。裸露的病毒在直射阳光下4048h即可灭活，如果用紫外线直接照射，可迅速破坏其活性。,8,不明原因肺炎检测实验室的设置,按传染性非典型肺炎实验室检测工作程序及的要求建立国家、省和地（市）级临床标本三级实验室检测网络体系。卫生部在中国CDC病毒病预防控制所(国家流感中心)和传染病预防控制所设立国家级检测实验室。广东省卫生厅确认省CDC（流感实验室）为我省中心实验室，广州市CDC为平行中心实验室。并建立覆盖全省的初筛实验室。,9,二、实验室生
5、物安全,为加强对传染性非典型肺炎实验室的管理工作，避免发生实验室内感染和对环境的污染，避免由于实验室操作不当造成SARS的传播，保障实验室人员的安全和健康，卫生部办公厅于2003年6月16日印发传染性非典型肺炎实验室生物安全操作规范。所有参与SARS防治和研究的实验室和实验室工作人员都必须遵守。同时废止2003年4月29日印发的传染性非典型肺炎实验室生物安全操作指南。,10,二、实验室生物安全,按照传染性非典型肺炎实验室生物安全操作规范的要求所有实验室人员应采取规范的生物安全防护，并经过相应的专业技术培训。凡操作活病毒的试验必须在生物安全III级（BSL-3）或以上级的实验室中进行。其余的临床
6、试验可在生物安全II级+（BSL-2+）实验室或全排式生物安全柜中进行。从事患者样品常规检验应使用专用实验室和仪器。,11,二、实验室生物安全,下列操作必须在生物安全3级(BSL3)或以上级实验室中进行：用细胞培养的方法分离病毒；收集或浓缩病毒或其培养产物；用活病毒或病毒的全基因接种动物。,12,二、实验室生物安全,下列操作必须在生物安全2级(BSL2)或以上级实验室，或全排式生物安全柜中进行：咽拭子/含漱液/痰液/尿/粪便/血清和血液等样品的诊断检测；溶解、固定或用其他方法处理灭活的病毒和(或)无传染性的病毒基因片段；常规的细菌和毒素检查；可能产生气溶胶的样品处理；临床样品的包装、分装；离心
7、管和离心机转头的封闭和开启。,13,二、实验室生物安全,实施上述操作的人员应具备如下防护措施：佩带N95级口罩，调整口罩的鼻金属夹，保证呼吸气体确经口罩过滤；佩带可以遮盖脸部的防护面罩或防护眼罩；佩带外科手术帽，并遮盖住双侧耳部；佩带2层外科手术乳胶手套。每完成一次可能接触含有病原的样品的操作后，应更换外层手套，再进行下一步操作；在普通实验白大衣外再穿着外科手术衣或连体隔离服(最好为防水材料)，双上肢佩带袖套，并用乳胶手套袖端将袖口覆盖、绷紧。双下肢穿着裤套，双脚穿鞋套，并用鞋套上部橡皮筋将裤套下段绷紧。,14,二、实验室生物安全,操作场地的消毒及污染物的处理： 实验完毕后，应将所有可用高压消
8、毒的用品和样品在实验室内进行高压消毒，不可用高压消毒的物品应用70乙醇消毒，实验室台面和污染的设备表面应用对脂包膜病毒有效的消毒剂消毒。实验室应用紫外线灯消毒。,15,二、实验室生物安全,按照传染性非典型肺炎实验室生物安全操作规范的要求: 从事SARS患者样品临床常规检验的实验室亦应具备生物安全2级(BSL2)或以上实验室条件，具有专用的检验室，使用专用仪器设备，如血球计数仪、血气分析仪、血液生化分析仪等。,16,三、标本的采集、包装、运送及保存,1、采集对象疑似病例，临床诊断，确诊病例。密切接触者，一周内出现流感样症状者。不明原因肺炎住院患者。其他根据需要采集的对象：可能暴露于SARS/禽流
9、感病毒或潜在感染性材料的人员中出现的不明原因肺炎病例（如从事SARS/禽流感科研、检测、试剂和疫苗生产等相关工作人员）。,17,三、标本的采集、包装、运送及保存,2、标本采集人员 按照全国不明原因肺炎病例监测实施方案（试行）的规定：经过培训的医疗机构医生、护士或疾控机构的专业人员负责标本的采集，并填写标本登记表。采集标本时应按照有关规范做好个人安全防护。,18,三、标本的采集、包装、运送及保存,3、标本的种类及采集时机（之一）上呼吸道标本：鼻拭子(或咽拭子)、含漱液；下呼吸道标本：鼻咽或气管抽取液、支气管/肺泡灌洗液和肺组织活检标本；血液标本：血清和EDTA抗凝全血；粪便/尿液标本；尸检标本：
10、主要是肺和气管，应多部位取材。,19,三、标本的采集、包装、运送及保存,3、标本的种类及采集时机（之二） SARS预警病例的采样：至少采集鼻咽拭子（含漱液）、粪便（肛拭）和血清；急性期应尽早采集（发病后7天内）；恢复期在发病后24周时（发病20天后）采集；每隔3天采集一次标本进行病毒核酸和血清抗体检测；病程两周后,可每隔5天采样一次。,20,三、标本的采集、包装、运送及保存,3、标本的种类及采集时机（之三） 人禽流感预警病例的采样：采集患者发病后13天的咽、鼻拭子或含漱液，发病后7天内的急性期血清以及死亡病例的尸检肺组织、气管分泌物，进行病毒分离、病毒核酸和血清抗体的检测。采集患者发病后24周
11、的血清标本。,21,三、标本的采集、包装、运送及保存,4、标本采集的方法（之一） 参见广东省传染性非典型肺炎实验室检测工作指引（试行）、人禽流感样品采集、运输和检测技术规范（试行）或国标流行性感冒诊断标准及处理原则。病毒分离标本：注意无菌操作。血清标本：双份血清；空腹采血510ml。,22,三、标本的采集、包装、运送及保存,4、标本采集的方法（之二）鼻拭子：将棉签轻轻插入鼻道内鼻腭处，停留片刻后缓慢转动退出。以同一拭子拭两侧鼻孔。将棉签浸入45ml采样液中，尾部弃去。咽拭子：用棉签擦拭双侧咽扁桃体及咽后壁，同样将棉签头浸入45ml采样液中，尾部弃去。,23,三、标本的采集、包装、运送及保存,4
12、、标本采集的方法（之三）漱口液：用10ml洗液漱口。漱时让患者头部微后仰，发“ao”声，让洗液咽部转动。然后收集洗液。鼻洗液：头微后仰，用移液管将11.5ml洗液注入一侧鼻孔，嘱患者同时发K音以关闭咽腔。然后让患者低头使洗液流出，用平皿或烧杯收集洗液。重复数次，最多可用1015ml洗液。注意：不要使用含青霉素的标本运输液，以免过敏。,24,三、标本的采集、包装、运送及保存,4、标本采集的方法（之四）鼻咽抽取物：用与负压泵相连的收集器从鼻咽部抽取粘液。先将收集器头部插入鼻腔，接通负压，旋转收集器头部并缓慢退出。收集抽取的粘液，并用采样液涮洗收集器3次。肺活检材料：在无菌条件下，用灭菌过的乳钵磨碎
13、肺活检组织，用NS配成20%悬液，2000rpm离心10min，取上清加入相应抗菌素。,25,三、标本的采集、包装、运送及保存,4、标本采集的方法（之五）尿液标本：同时采集双份10ml尿液分别加入两个无菌螺口塑料瓶中，密封，4条件下立即送至有关实验室。粪便（或肛拭子）：同时采集1020g粪便双份（或用塑料杆人造纤维头的肛拭子两支）分别放入两个含有10mlPBS或生理盐水的50ml无菌有螺旋盖的塑料瓶内，密封，4条件下立即送至有关实验室。,26,三、标本的采集、包装、运送及保存,4、标本采集的方法（之六）血清标本：应包括双份血清510ml。血液标本20002500rpm离心15min，收集血清，
14、无菌条件下移至带有垫圈的螺旋盖塑料血清管中。可在4存放一周，长期保存置-20。用EDTA抗凝管收集全血标本。尽量空腹采集血液标本。上述标本（除全血外）若不能在规定时间内送出，则应尽快在70 保存。,27,三、标本的采集、包装、运送及保存,5、标本的包装与运送（之一）标本必须放入合适的带螺旋盖内有橡胶圈的塑料管里。在塑料管上用油性笔写明样本种类、采样时间、编号、姓名，并详细填写“送检登记表”，用另一塑料袋密封。将装标本的密封袋放入带螺旋盖内有橡胶圈的塑料容器内，拧紧盖，在二级容器上标明有关信息。将二级容器摆放在专用运输箱内（或疫苗运输箱），放入冰排，然后以柔软物质填充，并密封。,28,三、标本的
15、采集、包装、运送及保存,5、标本的包装与运送（之二）同一患者两份以上标本，可以放在同一个二级容器内。二级容器要承受不少于95Kpa的压力，内衬具吸水和缓冲能力的柔软物质。病毒分离标本可将一级容器直接放入液氮运输罐内运输。所有容器必须印有生物危险标识。标本不得邮寄；应使用航空或铁路运输；近距离样品运送最好使用专车专人（2人）。,29,三、标本的采集、包装、运送及保存,6、标本的保存用于病毒分离标本应尽快接种，24h内接种的可于4暂存；不能在24h内接种的置-70保存；如无-70保存条件，则于-20冰箱暂存。血清标本可在4保存13天，-20或以下可长期保存；标本运送期间应避免反复冻融。所有标本一式
16、两份，其中一份单独保存备复核。,30,三、标本的采集、包装、运送及保存,7、标本的接收广州、深圳、佛山、韶关、汕头、云浮、湛江和珠海市CDC为本辖区内标本接收指定单位，并开展相关的实验室检测工作。广东省CDC负责其它地级市样本的接收和检测工作。并对复核样本检测、鉴定和上送中国CDC。以上指定实验室实行24小时标本接收制。,31,四、不明原因肺炎的实验室检测,1、经典检测方法病毒分离与鉴定：不适用常规检测，用于科研和疑难病例鉴定。SARS-CoV：接种人胚肺细胞或猴肾细胞培养分离病毒，再用补体结合试验或中和试验、IFA或ELISA等鉴定抗原。禽流感：用SPF鸡胚单腔法和MDCK组织细胞分离培养，
17、培养物用血凝试验（HA）和H5血凝抑制试验（HI）鉴定。微量血清中和实验:H5活病毒，必须在BSL-3级实验室里操作。 （具体操作参见国标流行性感冒诊断标准及处理原则）,32,四、不明原因肺炎的实验室检测,2、快速检测方法1）分子生物学检测：RT-PCR或Real-Time PCRSARS-CoV核酸检测禽H5亚型流感病毒核酸检测2）检测抗原的快速诊断试剂盒：敏感性较低，只能检测型特异性抗原。3）免疫荧光测定,33,四、不明原因肺炎的实验室检测,SARS-CoV核酸检测试剂 首选国家推荐使用的试剂：深圳匹基的SARS-CoV Real-time PCR检测试剂。中大达安基因的SARS-CoV
18、Real-time PCR检测试剂。 如果有条件，可以使用以下核酸检测试剂：美国CDC研制SARS-CoV Real-time PCR核酸检测试剂。德国罗氏RT-PCR核酸检测试剂，结果必须要测序。德国Artus的SARS-CoV Real-time PCR核酸检测试剂。,34,四、不明原因肺炎的实验室检测,SARS检测结果的确认 应用PCR方法，符合下列三项之一者判断为阳性：同一份临床标本在两个检测实验室使用两种不同的方法，或重复PCR方法检测阳性；至少两个不同部位的标本（如咽拭和粪便）检测阳性；不同病程（至少间隔2天）采集的同一种标本（如两份或多份咽拭）检测阳性；平行检测进展期和恢复期的血
19、清抗体，发生阳转或4倍以上升高，可做出SARS-CoV感染的实验室检测报告。,35,四、不明原因肺炎的实验室检测,禽H5亚型流感病毒核酸检测试剂用于禽H5亚型流感病毒快速检测、测序及排除；建议使用中国流感中心或WHO等权威部门推荐的引物和探针；建议使用德国QIAGEN的Rneasy Mini Kit (病毒核酸提取)和QIAquick Gel Extraction Kit(PCR产物纯化)产品。（源于禽流感实验室检测技术方案）,36,四、不明原因肺炎的实验室检测,以下情况的禽流感疑似病例原始标本及分离物送国家流感中心检测、复核、确认：分离物HA（+），同时HI（-），H5的RT-PCR检测阳性
20、；分离物HA（+），同时HI（+）或H5的RT-PCR检测阳性；分离物HA（+），同时H5的RT-PCR检测阳性;病人恢复期血清比急性期H5抗体有4倍或以上增高;标本分离阳性，HI（-），并已排除当前流行甲、乙型毒株的可能。 （HA-血凝实验;HI-H5血凝抑制试验）,37,四、不明原因肺炎的实验室检测,3、血清学试验SARS-CoV抗体：包括IgG、IgM或总抗体，任何一种抗体发生阳转或4倍及以上升高，均可诊断SARS。因IgG抗体持续时间较长，最好检测IgG抗体。禽流感病毒抗体：采集急性期和恢复期的双份血清同步检测。恢复期抗体滴度增高4倍或以上判断为阳性。其他抗体：有条件的单位首先要做支原
21、体、衣原体、HIV、RSV、腺病毒、流感病毒、军团菌等的排查检测。,38,四、不明原因肺炎的实验室检测,SARS-CoV抗体检测试剂 首选国家推荐使用的试剂：北京华大吉比爱公司的SARS-CoV IgM/IgG抗体ELISA检测试剂盒。军事医学科学院的SARS-CoV IgM/IgG抗体IFA检测试剂盒。 如果有条件，可以使用以下抗体检测试剂：欧盟（EuroImmunon）研制的SARS-CoV IgM/IgG抗体IFA检测试剂盒。香港大学研制的SARS-CoV IgM/IgG抗体IFA检测试剂盒。（源于广东省传染性非典型肺炎实验室检测工作指引（试行）,39,四、不明原因肺炎的实验室检测,4、
22、常规实验室检测项目外周血象：外周血白细胞计数（WBC）正常或降低，淋巴细胞计数绝对值减少，并呈逐步减低趋势。T淋巴细胞亚群：大多数SARS患者外周血CD3、CD4、CD8T淋巴细胞亚群减低，尤以CD4减低明显；CD4/CD8比值正常或减低。大部分禽流感患者CD4/CD8比值倒置。低氧血症：SARS患者动脉血血氧饱和度和氧分压都有不同程度下降，下降程度与病情严重程度密切相关。（WHO也报告，SARS的典型临床改变就是发热、肺部实变、血氧饱和度和氧分压下降。）其他：多数患者表现有肝功能和LD、CK的异常，并伴有电解质代谢紊乱。符合病毒性疾病引起多器官损害的特点。,40,五、实验室检测应注意的问题,标本采集的时机：采集不到急性期（发病7天内）血清时，尽可能采集早期血清以了解抗体动态变化。标本的上送及转运实验室生物安全：加强检测标本和SARS/禽流感病毒毒株的管理，严格执行操作规范，防止实验室的感染及传播。标本保存的条件：流感病毒在-20-40时不稳定，长期保存应在-70温度以下。,41,谢谢！,
