1、,同种异体骨移植修复过程中转化 生长因子1表达的实验研究,梁炳生 关海山山西医科大学第二医院骨科,前 言,转化生长因子1（ TGF-1）是一种多肽类多功能生长因子，可以调节多种细胞或瘤细胞的生长分化，在骨组织中受损伤刺激可启动新生骨与软骨的生成。动物实验证明，外源性TGF-1能够促进骨折愈合。目前认为，TGF-1表达量的变化可直接反映成骨能力的强弱，其基因表达信号的强弱可反映生成量的多少。,本研究采用免疫组化和原位杂交方法，观察分析同种异体骨移植修复过程中，术后时间、移植骨处理以及供受体间主要组织相容性抗原是否相配等因素对移植骨局部内源性TGF-1表达的影响，旨在为进一步研究异体骨移植愈合机理
2、以及临床合理使用重组生长因子提供实验依据。,材料与方法,本研究采用224三因素析因试验设计方法。根据供受体间主要组织相容性抗原是否相配将实验动物随机分为两个大组，即主要组织相容性抗原相配组和不配组。各大组再随机分为两个处理组，分别是新鲜异体骨移植组和冷冻异体骨移植组。,一、实验设计,表1：实验动物分组情况及处理,二、实验动物选择 选用健康、成年近交系LEW大鼠 （主要组织相容性复合体单倍体型Rt.1l）和近交系DA大鼠（主要组织相容性复合体单倍体型Rt.1a），雄性，体重270-320克。 北京大学医学部实验动物中心提供。,三、移植骨的制备 LEW和DA大鼠各12只做为供体。无菌条件下取其双侧
3、股骨，除去骨髓及附着软组织， 修剪成3mm4mm形状规则的半管状皮质骨块，0.9%氯化钠注射液反复冲洗。 将其中24块皮质骨（LEW、DA大鼠股骨各12块）装入双层无菌血浆袋中，热压封口，置入-20低温冰箱中冻存2周， 制成冷冻异体骨，植入前浸于30-37的0.9氯化钠注射液中复温30分钟。 将另外24块皮质骨做为新鲜异体骨，在2小时内植入受体。,四、动物模型建立 LEW大鼠48只做为受体。0.6%戊巴比妥钠（5ml /kg）腹腔注射麻醉，腹卧位固定，左后肢前外侧切口，长约3cm，切开皮肤、皮下组织，沿肌间隙分离，暴露股骨中段，口腔科高速裂钻截骨， 造成股骨干中段3mm4mm大小的骨缺损模型。
4、 将移植骨正位植入后，逐层缝合伤口。,五、主要试剂 TGF-1免疫组化试剂盒及TGF-1原位杂交试剂盒（武汉博士德生物工程公司提供）。,六、观察方法 取材后组织标本以10%中性福尔马林固定48-72小时；10%EDTA脱钙2周，梯度酒精脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，5um连续切片，分别进行HE染色，TGF-1免疫组化染色及原位杂交检测。光镜下观察各组移植骨修复情况。,将已判定为阳性的组织切片，随机抽样做空白对照，以PBS缓冲液代替一抗或杂交液。其他步骤不变。以空白对照实验的染色程度确定是否阳性, 空白实验染色强度为阴性,空白对照染色强度为阳性。阳性表达以组织和/或细胞胞浆内出现棕黄色颗粒为判断标
5、准。以乳腺癌标本作为阳性对照。,七、图像分析和统计学方法 1骨组织形态计量分析 每张HE染色组织切片随机选取5视野，经计算机自动图像处理系统计算新生骨组织密度。 新生骨组织密度=新生骨组织面积/总骨面积。 2TGF-1原位杂交结果图像分析 将原位杂交组织切片随机选取 5个视野，经计算机自动图像处理系统提取图中表达阳性信号彩色阈值，计算平均光密度值。,以上数据统计学处理采用SAS软件，进行224析因方差分析。 数据以均数标准差表示，P0.05有显著性差异。,结 果,一、组织学观察 主要组织相容性抗原相配的新鲜异体骨移植： 骨吸收不明显，死骨含量少。 术后1周，移植骨表面、髓腔及移植骨-宿主骨间隙
6、有新生骨样组织生成；2周时，移植骨浅表处生成编织骨；4周，板层骨与编织骨掺杂出现； 8周，板层骨排列整齐与移植骨紧密地整合在一起，髓腔再通。 上述部位增殖、分化的成骨细胞、间充质细胞内TGF-1蛋白及mRNA表达阳性。, 主要组织相容性抗原相配的冷冻异体骨移植： 移植骨边缘有骨吸收现象，骨内有死骨成分。 术后第2周，移植骨周围、髓腔及移植骨-宿主骨间隙有新生骨样组织出现；4-8周时，板层骨、编织骨掺杂出现且位置表浅，髓腔内有残余骨小梁。 移植骨周围、髓腔及移植骨-宿主骨间隙增殖、分化的成骨细胞、间充质细胞内TGF-1蛋白及mRNA表达阳性。, 主要组织相容性抗原不配的新鲜异体骨移植： 骨吸收活
7、跃，且移植骨周围有大量多核巨细胞浸润。 术后2周， 移植骨边缘及髓腔内有少量新生骨样组织出现；至8周时，新生骨组织很少，移植骨内仍有大片均质状死骨。髓腔无再通迹象。 上述部位增殖、分化的成骨细胞、间充质细胞内TGF-1蛋白及mRNA表达阳性。, 主要组织相容性抗原不配的冷冻异体骨移植： 移植骨边缘有骨吸收现象，骨内有死骨成分。 术后2周，新生骨样组织出现； 4-8周时，板层骨、编织骨掺杂出现，位置表浅，与移植骨整合不紧密，髓腔内有残余骨小梁。 TGF-1蛋白及mRNA表达主要定为于新生骨组织表面的成骨细胞、间充质细胞内。,图1术后2周，主要组织相容性抗原相配的新鲜异体骨移植（HE 100）图2
8、术后2周，主要组织相容性抗原相配的冷冻异体骨移植（HE 100）图3术后2周，主要组织相容性抗原不配的新鲜异体骨移植（HE 100）图4术后2周，主要组织相容性抗原不配的冷冻异体骨移植（HE 100）,图 1 图 2,图 3 图 4,图 5术后1周，主要组织相容性抗原相配的新鲜异体骨移植（ISH 100）图 6术后1周，主要组织相容性抗原相配的冷冻异体骨移植（ISH 100）图 7术后2周，主要组织相容性抗原不配的新鲜异体骨移植（ISH 100）图 8. 术后2周，主要组织相容性抗原不配的冷冻异体骨移植（ISH 100）,图 7 图 8,图 5 图 6,图 9 图 10,图 11 图 12,2
9、,图 9术后4周，主要组织相容性抗原相配的新鲜异体骨移植（IHC 100）图 10术后4周，主要组织相容性抗原相配的冷冻异体骨移植（IHC 100）图 11术后8周，主要组织相容性抗原不配的新鲜异体骨移植（IHC 100）图 12术后8周，主要组织相容性抗原不配的冷冻异体骨移植（IHC 100）,1随时间延长新生骨组织密度逐渐增高，术后第8周新生骨组织密度最高（P0.05）。 2主要组织相容性抗原相配与不配者之间新生骨组织密度有显著性差异（P0.05）。,二、骨组织形态计量分析,3冷冻异体骨移植与新鲜异体骨移植之间新生骨组织密度有显著性差异（P0.05）。 4. 主要组织相容性抗原相配的新鲜异
10、体骨移植新生骨组织出现最早，成骨效果最好，术后8周与其他各移植骨相比新生骨组织密度最高（P0.05）。,表2 骨组织形态分析结果,主要组织相容性抗原相配 主要组织相容性抗原不配时间(周) 新鲜异体骨 冷冻异体骨 新鲜异体骨 冷冻异体骨 1 0.20000.0033 0.13920.0029 0.10700.0032 0.14110.0073 2 0.52360.0188 0.36730.0196 0.15370.0065 0.37010.0020 4 0.61930.0174 0.48150.0135 0.21180.0024 0.43260.0238 8 0.76150.0200 0.703
11、00.0106 0.30630.0159 0.69890.0096,1 2 4 8,图13 骨组织形态计量分析结果,时间（周）,1供受体间主要组织相容性抗原是否相配影响TGF-1mRNA的表达强度（P0.05）。 2移植骨冷冻处理影响TGF-1mRNA的表达强度(P0.05)。 3术后时间影响TGF-1mRNA的表达强度（P0.05）。术后8周时TGF-1mRNA表达水平最低。 4时间、移植骨处理以及主要组织相容性抗原是否相配等因素之间存在交互作用（P0.05）。,三、TGF-1mRNA原位杂交检测图像分析,主要组织相容性抗原相配 主要组织相容性抗原不配 时间(周) 新鲜异体骨 冷冻异体骨 新
12、鲜异体骨 冷冻异体骨 1 1.41750.0029 0.99850.0144 0.24090.0075 0.45540.0128 2 0.84700.0085 0.70870.0016 0.25910.0015 1.05440.1224 4 0.61020.0035 0.49940.0017 0.25330.0103 0.48830.0161 8 0.47500.0047 0.41960.0018 0.24380.0061 0.42170.0187,表3 术后不同时间各移植骨TGF-1mRNA表达强度（平均光密度值）,影响因素 F值 P值 主要组织相容性抗原(A) 1277.55 0.05 移
13、植骨处理(B) 71.19 0.05 术后观察时间(T) 449.16 0.05 AB 887.30 0.05 BT 67.89 0.05 AT 393.78 0.05 ABT 30.99 0.05,表4 224析因分析结果,1 2 4 8,时间（周）,图14 术后不同时间各移植骨TGF-1表达强度（平均光密度值）,讨 论,一、骨移植修复过程中TGF-1的表达特征 目前已经知道，骨损伤修复过程中，TGF-1早期主要源于血小板和局部血液凝固。 血小板脱颗粒释放TGF-1，刺激修复细胞如间充质细胞，成骨细胞增殖、分化，启动修复过程。局部的成骨细胞、破骨细胞可在TGF-1的调节下使骨吸收、骨形成协调
14、进行。,本研究发现，异体骨移植修复过程中，移植骨局部TGF-1的表达水平与成骨效果协同变化，随骨组织逐渐成熟而发生量的变化， 呈现出由高到低的缓慢下降趋势，提示了在移植骨修复过程中，局部内源性TGF -1对骨形成、骨改建起着重要调节作用， 它可以根据损伤修复所需的生物学环境而发生量与分布的变化。,现已证实，TGF-1可诱导间充质细胞向成软骨细胞、成骨细胞转化， 以软骨内成骨或膜内成骨的方式成骨。 本研究观察到，异体骨移植成骨过程主要是以膜内成骨方式进行，软骨内成骨很少。 原位杂交结果显示，在膜内成骨阶段TGF-1mRNA表达量最高，随即呈现出下降趋势。,这可能是骨移植时局部出血较少，有氧环境利
15、于间充质细胞向成骨细胞转化，以膜内成骨的方式形成骨组织。这与骨折愈合过程中， 局部TGF-1mRNA的表达特征明显不同，即没有与软骨内成骨阶段有关的第二次峰值出现。,二、免疫排斥反应抑制TGF-1的表达 本研究表明，主要组织相容性抗原不配的同种异体骨移植的成骨效果明显不如组织抗原相配者。原位杂交结果也显示出同样的抑制特征。这说明供受体间主要组织相容性抗原不配抑制骨移植的修复过程以及局部内源性TGF-1的表达。这一结论与以往研究结果是一致的。,研究证明，骨细胞膜及细胞外骨基质中含有大量I、II类抗原分子。异体骨移植可以呈递抗原，诱发宿主产生以局部细胞免疫反应为主的排斥反应，导致移植骨周围炎性细胞
16、浸润，毛细血管狭窄、闭塞，移植骨修复过程延迟或移植骨被超前吸收。,同时，免疫排斥反应过程中还产生了许多细胞因子，如IL-1，TNF-等，它们除参与免疫调节外，还可激活破骨细胞的活性促进破骨并抑制成骨。体外研究发现，IL-1，TNF-可以促进FAS介导的人类成骨细胞凋亡，抑制TGF-1的表达。,尽管同种异体骨植入体内后，处于一个低水平的免疫反应状态，不存在异体器官移植所出现的超急性排斥反应，但仍会给骨修复、塑型、重建带来不利影响，反映在分子水平上表现为 TGF-1 表达水平的降低或延迟。,三、移植骨冷冻处理对TGF-1表达的影响 现已证实，异体骨经低温冷冻处理后可以降低其免疫原性，但同时其生物学
17、活性也被减弱。这一现象的发生可能是移植骨内存活细胞死亡造成的。因为低温冷冻处理对移植骨而言，不仅仅是一个低温储藏的过程，植入前移植骨往往需要解冻，冻融的变化过程在改变抗原结构的同时，也会引起骨内存活细胞膜结构的破坏导致骨内细胞死亡。,本研究结果显示，低温冷冻处理对主要组织相容性抗原相配与不配的异体骨移植会造成两种截然不同的结局：对组织抗原相配者而言，表现为骨掺入延迟，TGF-1mRNA表达水平降低；而对于组织抗原不配者，则表现为骨掺入加快，TGF-1mRNA表达水平增高，并且在术后第2周达到高峰。这也说明了低温冷冻造成骨内存活细胞死亡以及细胞膜破坏，使与膜结构有关的抗原结构改变，移植物免疫原性
18、下降。,以往研究表明，移植骨的生物学作用主要体现在以下三个方面：一是提供移植骨本身内在的生物学活性物质，即骨内存活细胞及其产物；二是骨基质内活性生长因子诱导宿主来源的未分化间充质细胞成骨，即骨诱导作用；三是充当宿主新生骨组织长入的支架，即骨传导作用。,本研究观察到，在冷冻异体骨移植物的周围及靠近边缘的部位有新生骨组织形成，同时局部也有TGF-1mRNA及蛋白质存在。 证明了冷冻异体骨移植，后两种成骨途径是可能的。但是这种源于骨吸收后细胞外基质内细胞因子的成骨将是十分缓慢的，并且新生骨组织总是出现在移植骨表浅的部位，不会与移植骨很好地整合在一起。,Enneking等也发现冷冻骨内部“爬行替代”主
19、要发生在移植骨浅表面及两端，移植后5年，移植骨仅有20%被新骨替代，深层未修复部分仍保持原结构。,四、多种因素交互作用影响TGF-1的表达 同种异体骨移植修复过程中，时间、移植骨处理以及主要组织相容性抗原是否相配等因素相互作用影响移植骨局部内源性TGF-1mRNA的表达。本研究证实，主要组织相容性抗原相配的新鲜异体骨移植，在术后1周TGF-1 mRNA表达强度最高，并且新生骨组织出现最早，成骨效果最好。,本研究发现，主要组织相容性抗原相配的异体骨在冷冻以后，移植骨局部TGF-1 mRNA表达降低，而组织抗原不配者则相反。说明主要组织相容性抗原是否相配与移植骨冷冻处理交互作用影响 TGF-1mR
20、NA的表达。此外，对于新鲜异体骨而言，主要组织相容抗原差异是影响TGF-1 mRNA表达的关键因素，对于冷冻异体骨而言，主要组织相容性抗原差异的影响就显得不甚重要了。,五、结语 1同种异体骨移植的修复过程是一个复杂的生物学行为，单一生长因子并不能解释其全部内容。关于其它因子的表达以及局部应用生长因子促进骨修复等问题还有待于进一步研究。,2本研究采用免疫组化染色和原位杂交技术检测移植骨修复过程中修复细胞内及细胞外TGF-1的表达及分布情况，从蛋白质水平及mRNA水平测到 TGF-1 在相应细胞内存在，可以完整地说明该细胞因子在相应细胞中从头合成并经加工处理产生有活性因子。,结 论,1本研究证明，在移植骨修复过程中，局部内源性TGF-1对骨形成，骨改建起着重要调节作用，它可以根据损伤修复所需的生物学环境而发生量与分布的变化。 2同种异体骨移植修复过程中，供受体间主要组织相容性抗原不配抑制局部内源性TGF-1表达，在组织形态学上表现为移植骨修复过程的延迟或抑制。,谢 谢！,
