1、药物分析,维 生 素 类 药 物 的 分 析,第 十四 章,游 奎 一,湘 潭 大 学 化 工 学 院,公元前3500年-古埃及人发现能防治夜盲症的物质，也就是后来 的维A。1600年-医生鼓励以多吃动物肝脏来治夜盲症。1747年-苏格兰医生林德发现柠檬能治坏血病，也就是后来的维C。1831年-胡萝卜素被发现。1905年-甲状腺肿大被碘治愈。1911年-波兰化学家丰克为维生素命名。1915年-科学家认为糙皮病是由于缺乏某种维生素而造成的1916年-维生素B被分离出来。,1920年-发现人体可将胡萝卜转化为维生素A。1922年-维E被发现。1928年-科学家发现维B至少有两种类型。1933年-维
2、E首次用于治疗。1948年-大剂量维C用于治疗炎症。1949年-维B3与维C用于治疗精神分裂症。1954年-自由基与人体老化的关系被揭开。1957年-Q10多酶被发现。1969年-体内超级抗氧化酶被发现。1970年-维C被用于治疗感冒。1993年-哈佛大学发表维生素E与心脏病关系的研究结果。,本 章 基 本 要 求,一、掌握维生素类药物的结构特点与分析方法之间的关系。二、掌握维生素类药物的鉴别原理与方法。三、掌握三点校正法测定维生素A的原理、测定方法与计算方法四、掌握维生素D的HPLC含量测定法和维生素E的GC含量测定法五、掌握维生素B1非水溶液滴定法与维生素C碘量法的测定原理 方法与注意事项
3、。六、熟悉本类药物其他的含量测定方法七、熟悉本类药物杂质检查方法八、了解维生素A三点校正法的推导过程,概 述,维生素： 是维持人体正常代谢机能所必需的微量活性营养物质。 人体不能合成维生素。,VitA、D2、D3、 E、K1 等,脂溶性维生素:,水溶性维生素:,VitB族(B1、B2、B6、B12) VitC、叶酸、烟酸、泛酸等,分类,按溶解度可分为:,概 述,VitM,尼克酸,-H 维生素A醇-COCH3 维生素A醋酸酯-COC15H31 维生素A棕榈酸酯,R :,第一节 维生素A,为一个具有共轭多烯侧链的 环己烯,（一）,结构与性质,一、,具有UV吸收,存在多种立体异构化合物,易发生脱氢、
4、脱水、聚合反应,VitA2,VitA3,去氢维生素A,去水维生素A,鲸醇(维生素A醇的二聚体),或有金属离子存在时氧化,结构与性质,一、,(三) 溶解性: 不溶于水,易溶于有机溶剂 和植物油等,环氧化物,VitA醛,VitA酸,条件: 无水无醇,CHCl3,蓝色,紫红,（BP（2000）,max为326nm一个吸收峰,max为348,367,389nm三个吸收峰,去水VitA（VitA3）,VitA,326nm,348nm,367nm,389nm,USP 显色剂 磷钼酸 规定斑点颜色和Rf值,BP 杂质对照品法 显色剂 : 三氯化锑,立体异构体氧化降解产物合成中间体,UV法,（一）,维生素A2
5、维生素A3环氧化物维生素A醛维生素A酸,三点校正法（法定方法）原理：（1）杂质的吸收在310340nm波长范围内呈一条直线，且随波长的增大吸收度减小；（2）物质对光的吸收具有加和性。,2. 波长的选择：（1） 1 VitA的max（328nm）（2） 2 3 分别在1的两侧各选一点,测定对象: VitA醋酸酯,= 12nm,测定对象: VitA醇,1=325nm, 2=310nm, 3=334nm,第一法：直接测定法（1）基本步骤:第一步 测定吸光度，确定最大吸收波长,3. 测定法,注意： C 为混合样品的浓度,第二步 求,第三步 求效价,换算因数由纯品计算而得：,第四步：求标示量,方法：,第
6、一法,适应于纯度高的维生素A醋酸酯,直接测定法,判断 是否在326329nm之间,在326329nm之间,改用第二法,是,否,求算 并与规定值比较,规定值 差值,判断差值是否超过规定值的,有一个以上超过,无超过,计算 A328（校正）,用A328计算,第二法,第二法,f值,讨 论,VA醋酸酯的吸收度校正公式是用直线方程式法（即代数法）推导而来；VA醇的吸收度校正公式是用相似三角形法（几何法或称6/7定位法）推导而来。在应用三点校正法时，除其中一点在最大吸收波长处测定外，其余两点均在最大吸收峰的两侧进行测定。在测定前务必要校正波长。测定的样品应不得少于两份。,VitAD胶丸中VitA的含量测定
7、精密称取本品装量差异项下的内容物 0.1287g (规格10000VitAIU/丸,平均装量0.07985g/丸)至10ml烧杯中，加环己烷溶解并定量转移至50ml量瓶中，用环己烷稀释至刻度，摇匀；精密量取2.0ml，置另一50 ml量瓶中，用环己烷稀释至刻度，摇匀。以环己烷为空白，测定最大吸收波长为328nm，并在下列波长处测得吸收度为,A300 ：0.374A316 ：0.592A328 ：0.663A340 ：0.553A360 ：0.228,A300 /A328 ：0.564A316/A328 ：0.893A328/A328 ：1.000A340/A328 ：0.834A360/A32
8、8 ：0.344,求本品中维生素A占标示量的百分含量？,A300 /A328 ：0.564A316/A328 ：0.893A328/A328 ：1.000A340/A328 ：0.834A360/A328 ：0.344,0.555 0.907 1.000 0.811 0.299,+ 0.010.01 0 + 0.02 + 0.04,=,A328(校正) = 3.52 ( 2A328 - A316 - A340 ) =3.52 ( 20.663 0.592 0.553 ) =0.637,适用于维生素A醇,（等吸收比法）,第一法无法消除杂质干扰时用此法, 皂化法、6/7A法 ,（3）第二法,水溶性
9、,脂溶性,并确定最大吸收波长（325nm),判断max是否在323327nm之间,取未皂化样品采用色谱法纯化后再测定,计算,是,否,判断 A300 /A325 是否大于0.73,是,否,取未皂化样品采用色谱法纯化后再测定,计算A325(校正),0,3%,3%,HPLC法,（二）,适合于维生素A醋酸酯原料和制剂中维生素A的含量测定。,高效液相色谱仪，紫外检测,固定相：硅胶为填充剂流动相：正己烷：异丙醇=997:3检测波长：325nm,三氯化锑比色法,（二）,优点 : 简便、快速,max 618nm620nm,标准曲线法定含量,（三）,第二节 维生素B1的分析,维生素B1广泛存在于米糠、麦麸和酵母
10、中，还可以人工合成。 具有维持糖代谢及神经传导与消化的正常功能，主要用于治疗脚气病，多发性神经炎和胃肠道疾病。,氨基嘧啶环CH2噻唑环(季铵碱),第二节 维生素B1的分析,HCl,Cl-,盐酸硫胺,（一）,溶解性,1、易溶于水,2、水溶液呈酸性,（二）,UV,共轭双键,max = 246nmE1%1cm=406436,与生物碱(K2HgI4,硅钨酸等）,（三）,硫色素反应,（四）,（五）盐酸根 呈氯化物的反应，用于鉴别。,铁氰化钾,ChP,鉴别试验,二、,-2H,硫色素,2H,VitB1,H+,H+,H+,H+,S元素反应,Cl-反应,(,),2,1,PbS,NaS,VitB,NO3,Pb,N
11、aOH,以电位法指示终点,反应摩尔比为1：2,UV法,（二）,片剂、注射剂,= 421,（每片）相当于标示量的%=,A = ECL,g/100ml,ChP,（每ml）相当于标示量的%=,规格g/ml,ml,%,V,E,A,%,cm,100,1,100,1,1,标示量,稀释倍数,原理,1、,荧光,硫色素,异丁醇,铁氰化钾,1,VitB,NaOH,或正丁醇,（1）灵敏度高，线性范围宽;（2）代谢产物不干扰，适用 于体液分析.,第三节 维生素C的分析,维生素C又称L-抗坏血酸，在化学结构上跟糖类物质十分相似，有四种光学异构体，其中以L-构型右旋体生物活性最强。 常见的有：泡腾片，泡腾颗粒等。,第三节
12、 维生素C的分析,L抗坏血酸,*,*,结构特点：,烯二醇,内酯环,手性碳,2、水溶液呈酸性,C3OH的pKa = 4.17,C2OH的pKa = 11.57,一元酸,L(+)抗坏血酸活性最强,手性C（C4、C5）,*,*,二烯醇结构,二酮基结构,二烯醇结构,有活性,有活性,无活性,二酮古洛糖酸,去氢抗坏血酸,与碱反应,酮酸盐,糖类的显色反应,50,结构与糖类相似,（七）紫外吸收特性,具有共轭双键，其稀盐酸溶液在243nm处有最大吸收波长。百分吸收系数为560.在中性或碱性条件，吸收红移，265nm处。,1、与AgNO3反应,2、与2，6 - 二氯靛酚反应,(ChP2010),氧化型,玫瑰红色,
13、(ChP2010),（玫瑰色）,（无色）,3.其他氧化剂的反应：亚甲蓝或高锰酸钾 试剂褪色碱性酒石酸铜 砖红色沉淀磷钼酸 钼蓝,4. 薄层色谱法,薄层板：GF254,展开剂：乙酸乙酯-乙醇-水=5:4:1,紫外灯：254nm,或盐酸,50,吡咯,USP,（蓝色）,(糠醛),（戊糖）,50,(吡咯),BP2010,0.01mol/L HCl,三、杂质检查,1.溶液的澄清度与颜色：有色杂质 分光光度法2.铁、铜离子：原子吸收分光光度法 3. 草酸的检查：与钙离子反应是否生成沉淀,指示剂: 淀粉指示液,H+,取本品约0.2g，精密称定，加新沸过的冷水100ml与稀醋酸10ml使溶解，加淀粉指示液1m
14、l，立即用碘滴定液（0.05mol/L）滴定，至溶液显蓝色，在30秒内不褪。每1ml碘滴定液(0.05mol/L)相当于8.806mg的C6H8O6,（1）酸性环境 d . HCl,（2）新沸冷H2O,减慢VitC被O2氧化速度,（3）立即滴定,赶走水中O2,减少O2的干扰,（4）附加剂干扰的排除,片剂 滑石粉 过滤,注射剂 抗氧剂 ,丙酮甲醛,USP32,JP15,酚亚胺,二氯靛酚,VitC,无色,（2）快速滴定 2min内,（1）酸性环境 HPO3-HAc,稳定VitC,防止其他还原性物质干扰,（3）剩余比色测定,（定量过量）,（测剩余染料）,（4）缺点,需经常标定,贮存一周,不稳定,干扰
15、多 氧化力较强,（三）HPLC法,色谱柱：C18 ODS（4.6mm20cm,5um)流动相：甲醇-5%偏磷酸=2.5:97.5流速：1ml/min检查波长：245nm柱温：25 0C,分析条件：,第四节 维生素D的分析,维生素D2,一、结构与性质,一类抗佝偻病维生素的总称,维生素D3,1,2,5,4,3,6,7,8,9,10,12,11,19,13,14,15,16,17,18,20,21,22,23,24,25,26,27,二、性质,1、性状：无色针状结晶或结晶粉末，易变质,2、溶解性：水中不溶，易溶有机溶剂（CHCl3等）,3、不稳定性：含烯键，易被氧化,4、旋光性：具有手性碳,5、显色
16、反应： CHCl3中加醋酐与硫酸显黄色，逐渐 变红色，再迅速变紫色，最后变绿色,6、紫外吸收特性：最大吸收265nm,D2吸收系数460490，D3:465495,开环的甾体：具有甾类化合物的显色反应，可用于鉴别。,手性碳原子：具有旋光性，可用于鉴别。,多烯：可进行紫外检测。,二、鉴别试验,1. 显色反应,三氯化锑反应 橙红色渐变粉红,三氯化铁反应 橙黄色,二氯丙醇和乙酰氯反应 绿色,可用于鉴别，但专属性不强,2. 比旋度鉴别,维生素D2,维生素D3,溶 剂,浓 度,比旋度值,无水乙醇,无水乙醇,40mg/ml,5mg/ml,+102.5+107.5,+105+112,注意事项：应于容器开启3
17、0分钟内取样， 在溶液配制后30分钟内测定。,以96%乙醇为溶剂，加乙醇和85%硫酸，D2显红色，在570nm处有最大吸收，D3显黄色，在495nm处有最大吸收。,3.其他方法： TLC、HPLC、制备衍生物测熔点,4.区别反应：,三、杂质检查,四、含量测定方法,第五节 维生素E的分析,维生素E为-生育酚及其各种酯类，有天然品和合成品之分。天然品为右旋体，合成品为消旋体。,苯并二氢吡喃醇,第五节 维生素E的分析,*,*,*,1,2,3,4,5,6,7,8,1，,3，,5，,7，,9，,11，,13，,dl生育酚醋酸酯,苯环 + 二氢吡喃环 + 饱和烃链,1、UV 最大吸收波长284nm,2、乙
18、酰化的酚羟基 易水解,醌型化合物,生育酚,-,+,or OH,H,VitE,杂质，需检查,3. 溶解性：维生素E为黄色粘稠液体，易溶于有机 溶剂，不溶于水,4. 氧化性：维生素E对热稳定，但易被氧化生成醌 形产物或聚合,生育红,（一）,硝酸反应,橙红色,（橙红色）,生育红,生育酚,HNO3,生育酚,对-生育醌,O,血红色,= 41.045.5,max = 284nm,min = 254nm,0.01%无水乙醇中,UV法,（三）,薄层板 硅胶G,展开剂 环己烷 -乙醚（4 ：1）,显色剂 硫酸（105 5）,-生育酚 醋酸酯Rf = 0.7-生育酚 Rf = 0.5-生育醌 Rf = 0.9,T
19、LC法,（四）,2. 游离生育酚,杂质检查,三、,原理:,酸度 以NaOH滴定液（0.1mol/L）体积控制。,（M生育酚= 430.8）,例,取本品0.10g，加无水乙醇5ml溶解后，加二苯胺试液1滴，用硫酸铈液（0.01mol/L）滴定，消耗硫酸铈液（0.01mol/L）不得过 1.0ml。,2.15,限量,GC法（法定方法）,（一）,选择性好灵敏度高速度快分离效能好,挥发性低、不稳定、极性强衍生化易受样品蒸气压限制,载气N2固定液硅酮（OV-17）二甲基聚硅氧烷柱温265检测器氢火焰离子化检测器(FID)内标正三十二烷 n 500 R2,内标法加校正因子,内标法:,供试液（样品+内标）,
20、内标物,对照液（对照+内标）,是样品中不存在的物质与被测组分峰靠近能与各组分完全分离与被测组分的量接近,校正因子：,f=(Asmi)/(Aims),Wi%=(Aifims)/(Asfsw) 100%,ms：内标物的质量mi: 被测物的质量Ai: 被测物的峰面积As:内标物的峰面积Wi: 被测物组分的百分含量W：混合样品的质量,（二）HPLC法 外标法 此外，还有铈量法、比色法和荧光法,练习与思考,A型题,1. 维生素B1的鉴别方法是A.三氯化铁反应 B. 硫色素反应 C.与碱性酒石酸铜试液反应 D. 双缩脲反应,2. 维生素E中国药典规定的含量 测定方法为A.非水溶液滴定法 B.旋光法 C.H
21、PLC法 D.紫外分光法 E.GC法,B型题,A.亚硝基铁氰化钠反应 B. 硫色素反应 C.硝酸反应 D. 三氯化锑反应 E. 硝酸银试液的反应 F.醋酐-浓硫酸 1. 维生素C 2. 维生素E 3. 维生素B1 4. 维生素A 5. 维生素D,E,C,B,D,F,D,X型题,1. 用碘量法测定的药物有A. 醋酸地塞米松 B. 丙酸睾酮 C. 维生素C D. 硫酸阿托品 E. 维生素C注射液,本章练习题,1. 用紫外分光光度法测定维生素A含量时，采用三点校正法的目的是什么?2. 维生素C具有哪些鉴别反应？用什么方法测定其含量?3. 维生素B1具有怎么样的性质？可用哪些方法进行鉴别？产生怎样的现象？4. 用什么方法鉴别维生素A、B1、C、D以及E?,
