1、第二章 清洗与消毒,培养用品的清洗,在细胞培养中，离体细胞对任何有害物质都十分敏感。有害物质包括微生物、细胞残余物以及非营养成分的化学物质。因此对新采用和重新使用的培养器皿，都要严格清洗。根据器皿的材料不同，清洗的方法和程序也不一样，要分别处理。1. 玻璃器皿的清洗2. 金属器械的清洗3. 橡胶制品的清洗4. 塑料制品的清洗,培养用品的清洗,1. 玻璃器皿的清洗1.1 浸泡：初次使用和培养用后的玻璃器皿都需先用清水浸泡，以使附着物软化或被溶解。1.2 刷洗：浸泡后的玻璃器皿一般仍然要用毛刷沾洗涤剂洗涤，以除去器皿表面的附着较牢的物质。1.3 浸酸：刷洗后的玻璃器皿往往还残留有极微量的杂质，经过
2、用浓硫酸和重铬酸钾配制的清洁液的强氧化作用或其他清洁液的作用后，即可被除掉。1.4 冲洗：刷洗和浸酸后都必需用自来水充分冲洗。,培养用品的清洗,1. 玻璃器皿的清洗2. 金属器械的清洗 金属器械包括医用解剖刀、解剖剪、眼科剪（直头和弯头）、镊子（中号）、小尖镊子、止血钳等。 原代培养使用后的玻璃器械应及时浸于清水中，先用纱布擦洗器械上沾有的血污等，再用自来水和蒸馏水冲净，最后用酒精棉球擦拭晾干，备用。3. 橡胶制品的清洗4. 塑料制品的清洗,培养用品的清洗,1. 玻璃器皿的清洗2. 金属器械的清洗3. 橡胶制品的清洗 细胞培养中使用的橡胶制品主要是密闭某些器皿的胶塞。新购置的胶塞带有大量滑石粉
3、应先用自来水冲洗干净后，再做常规处理。4. 塑料制品的清洗,培养用品的清洗,1. 玻璃器皿的清洗2. 金属器械的清洗3. 橡胶制品的清洗4. 塑料制品的清洗 塑料制品包括一次性塑料培养皿、细胞瓶、多孔培养板、移液枪的枪头和塑料滤器等。 目前我国组织培养使用的塑料器皿主要是从国外购置的 ，使用无毒并已经消毒灭菌、密封包装的商品。用时，只要打开包装即可，是一次使用性物品。,清洗液配制的操作方法,浓硫酸-重铬酸钾洗液1 根据具体情况选择合适大小的耐酸塑料桶或酸缸，加入一定量的去离子水。,浓硫酸-重铬酸钾洗液操作方法,2 按表所示比例，先将重铬酸钾溶解于去离子水中，为了溶解充分，边加边用玻璃棒搅拌；或
4、者用一个可以加热的容器，盛一定量水，加热溶解重铬酸钾，并不断搅拌，溶解后冷却，导入耐酸塑料桶或酸缸中。3 溶解完全并冷却后，缓慢加入浓硫酸，边加边用玻棒搅动，以混合液温度不过快上升和不出现重铬酸钾结晶为度。4 待混合洗液降到常温后，即可用来浸泡玻璃器皿。,浓硫酸-重铬酸钾洗液配制注意事项,1 清洗液具有高度腐蚀性，配制时注意保护身体裸露部分及面部，要戴手套、口罩、围裙，别溅到身上。2 加入浓硫酸时一定要缓慢，少量多次，每次加完后要轻轻搅动，然后静置2030min，冷却后在加入一次。3 新配制的清洁液为棕红色，经多次使用、遇有机溶剂或水分增多时变成绿色，表明失效，应重新配制。,培养用品的包装,1
5、. 局部包装：较大的瓶皿以及体积较小，但瓶口包装方便的容器，只把瓶口部分用硫酸纸包裹后，再罩以牛皮纸或棉布密包起来用线绳扎紧即可。2. 全包装：比较小的培养瓶皿、注射器、吸管、金属器械和胶塞等，需采用全包装，现多用装入铝饭盒方法。,培养用品的消毒灭菌,1. 物理灭菌法1.1 射线灭菌：利用X射线等发出的辐射进行灭菌消毒，一般实验室不具备射线发射条件，故很少采用。1.2 紫外线灭菌：方法简便、效果好，是目前各实验室常用的消毒灭菌方法之一，主要用于对空气、操作台表面和一些不宜使用其他方法进行消毒的培养器具（如塑料培养皿、培养板等）进行消毒。消毒时，物品不宜相互遮挡。,培养用品的消毒灭菌,1. 物理
6、灭菌法1.1 射线灭菌1.2 紫外线灭菌1.3 干热消毒：主要用于玻璃器皿的消毒，干热消毒后的器皿干燥，易于储存。但干热传导慢，需加温到160并保持90240min，才能杀死细菌、芽孢，达到消毒目的。应待温度降至80以下方可打开烘箱。1.4 湿热消毒：是最常见、最有效的一种灭菌方法，布类、胶塞、金属器械、某些玻璃器皿以及某些培养用液等都可采用此方法消毒灭菌。,培养用品的消毒灭菌,1. 物理灭菌法1.1 射线灭菌1.2 紫外线灭菌1.3 干热消毒1.4 湿热消毒1.5 滤过消毒：大多数培养用液，在高温高压下会发生变性，失去其功能，须采用滤过法除菌。,培养用品的消毒灭菌,1. 物理灭菌法2. 化学
7、灭菌法：包括煤酚皂溶液（来苏儿）、新洁儿灭、过氧乙酸和75%酒精等。主要用于操作者的皮肤、操作台表面、器械及无菌室内的座椅、墙壁、地面和空气等。3. 抗生素灭菌法：主要适用于培养用液消毒。为了预防因操作不慎等原因造成细胞培养污染。,玻璃器皿的清洗操作方法,1 浸泡：将上次实验后的玻璃器皿及时浸泡在清水中，注意让水完全浸泡，不要留有气泡。如果是新购置的玻璃器皿，则先用自来水简单刷洗，用于5%盐酸溶液浸泡过夜后用自来水流水冲洗（逐片进行），其后处理步骤和重复使用的玻璃器皿相同。2 刷洗3 泡酸4 冲洗,玻璃器皿清洗操作方法,1 浸泡2 刷洗：收集浸泡后器皿泡在洗衣粉液或洗洁精溶液中，用优质软毛刷刷
8、洗容器内外壁，尽量不要遗漏瓶底、边角等死角；对培养皿、烧杯等瓶口较宽的容器也可以用纱布擦洗。3 泡酸4 冲洗,玻璃器皿清洗操作方法,1 浸泡2 刷洗3 泡酸：用自来水充分冲洗玻璃上的洗衣粉液或洗洁精溶液，在浓硫酸-重铬酸钾清洁液（强液）中浸泡过夜。酸液配制时应注意安全，泡酸之前尽量甩干器皿内的水，以延长清洁液的使用寿命。4 冲洗,玻璃器皿清洗操作方法,1 浸泡2 刷洗3 泡酸4 冲洗：手戴橡胶手套，小心取出酸缸中的玻璃器皿，用自来水充分清洗去酸液后（1520遍），沥水，后依次在去离子水、二蒸发水和三蒸发水中润洗56次。注意不要有酸液残留， 以防止酸液烧伤皮肤、衣物等。,玻璃器皿包装操作方法,1
9、 收集润洗后的玻璃器皿于医用托盘中，置烘箱50左右烘干。2 瓶状玻璃器皿的包扎：采用局部包装，取出托盘，佩戴一次性塑料手套，先用硫酸纸（或铝箔）包住细胞瓶、烧杯、容量瓶、三角瓶及青霉素瓶等瓶状玻璃器皿的瓶口，再套一层牛皮纸，用线绳包扎即可。,玻璃器皿包装操作方法,3 培养皿的包扎：采用全包装，68个一起叠放起来后用硫酸纸和牛皮纸包成筒状。(a)，桌面铺好双层报纸；(b)，叠放68个培养皿放在报纸中央；(c)，卷起报纸，与平皿一起滚动；(d)，滚动的同时，将两边多余的报纸沿平皿折平。,玻璃器皿包装操作方法,4 管状培养器皿的包扎：吸管、移液管、滴管等管状培养器皿的包扎如下所示。(a)，将报纸沿纵
10、向裁出5cm宽长条；(b)，用回形针或大头针在移液管上端塞入少量棉花；(c)，将移液管的尖端放到纸条一端约2cm处，使其与纸条成45角，将报纸对角对折；(d)滚动移液管，并将报纸卷起；(e)，最后将多余的报纸打结。包扎后装入筒中灭菌。,玻璃器皿灭菌操作方法,将包装好玻璃器皿放在托盘上送入电热鼓风干燥箱中，密闭箱门，160170高温灭菌90180min，待烘箱温度降至室温后，取出托盘送入细胞培养室储物柜中存放。,玻璃器皿包装注意事项,1 使用后的实验器材应立即投入清水中。2 浸泡、煮沸、酸泡的器皿内要充满液体，不得有气泡。3 刷洗、酸泡后的器材要用流水振荡冲洗，不得残留洗涤剂、清洁液。方法是：每
11、瓶灌2/3容积的自来水，振荡后倒掉，重复1520次（尖滴管置量杯中冲洗）。,玻璃器皿包装注意事项,4 煮沸前的水面要高于器材5cm，水沸后投入洗涤剂（直径35cm的铝锅，用洗衣粉10g左右）。若洗涤剂和实验器材同时从冷水煮至沸腾或使用过量洗涤剂，均易腐蚀玻璃表面，使玻璃碱化，pH上升。5 软毛刷的刷端已掉毛的应该弃去，否则会损害玻璃。玻璃划痕处易残留洗涤剂，会改变培养液pH和毒害细胞。6 清洁物品应及时包装消毒，应注意妥善保存，防止落入灰尘、蟑螂、蚂蚁等引起二次污染。,玻璃器皿包装注意事项,7 使用后的胶塞与玻璃器材同时煮洗时，胶塞要放在煮锅的底部。8 浸泡器材的蒸馏水容器要专用，并做好标记，
12、如“蒸馏水I盆”、“蒸馏水II盆”。9 器材清洗干燥后，在以后各步操作时，手指不可接触器材的使用端。清洗者可戴一次型薄膜手套进行操作，省时又保证清洗质量。,玻璃器皿包装注意事项,10 用超声波仪清洗器材时，清洗要求同上。11 清洗用的洗衣粉最好选择质软、去污效果好的，如汰渍洗衣粉等，不要选用溶解后还留有颗粒的劣质洗衣粉，以免划伤玻面。12 配制浓硫酸-重铬酸钾清洁液（强液）时应注意先溶解重铬酸钾，再小心加入浓硫酸；取、放浸泡实验用品时应戴橡胶手套，防止酸液溅到衣物、皮肤而造成伤害。,玻璃器皿包装注意事项,13 刷洗细胞瓶、培养板等细胞需贴壁生长的器皿时，应注意防止玻面的划伤，影响到显微镜下细胞
13、生长情况的观察，可以用纱布蘸油脂洗涤剂小心擦洗。14 电热鼓风干燥箱干热灭菌结束后，不要立即打开箱门，以免玻璃突然遇到冷空气炸裂，应让其温度降至80以下方可打开烘箱。15 培养器皿包扎紧密、结实、不松散。16 管状培养器皿中塞入的脱脂棉要松紧适宜，过松易脱落，过紧不透气妨碍使用。,金属器械清洗的操作方法,1 清洗：手术刀、解剖剪、止血钳、镊子等金属器械用后应及时在清水中浸泡510min，用纱布蘸取洗涤液洗去表面血污、残余组织块及其他杂物后，自来水冲洗1015次，再佩戴一次性塑料手套，用三蒸水漂洗35次，甩干，用酒精棉球擦拭。新购进的金属器械涂有防锈油，先用沾有汽油的纱布擦去油脂，再用水洗净，最
14、后用酒精棉球擦拭，晾干。,金属器械包装、灭菌的操作方法,2 包装：将清洗后的金属器械用23层纱布简单包裹后，放入铝饭盒中，饭盒再以牛皮纸包好，绳扎好。准备灭菌。3 灭菌：将铝饭盒送入高压蒸汽灭菌锅中121、30min灭菌。,塑料用品清洗、包装和灭菌操作方法,1 实验用完的塑料培养瓶、培养皿、多孔培养板等及时浸入清水中68h以上。如残留有较大附着物，可先用脱脂棉擦拭掉，再用流水冲洗干净浸入清水中浸泡。2 将在清水中浸泡好的塑料培养瓶、培养皿等取出，自来水简单冲洗后，2%NaOH溶液中浸泡过夜。3 佩戴塑料手套取出浸泡过夜的用品，自来水冲洗810次，2%5%盐酸溶液浸泡1530min。,塑料用品清
15、洗、包装和灭菌操作方法,4 从盐酸中取出用具后用自来水冲洗多次，再用三蒸水漂洗56次，倒净器皿内的残水，置37恒温箱内晾干。5 紫外灯下照射3h以上。照射后，无菌存放于储物柜中。凡能耐热的塑料器皿，最好经101.3kPa（121）高压灭菌。,塑料用品的清洗、包装和灭菌注意事项,塑料制品紫外灭菌时，应打开塑料容器的塞子（细胞瓶）、盖子（培养皿）等，灭菌物品之间也不要互相叠放，以充分暴露灭菌部位于紫外灯下。,橡胶制品（胶塞、胶管、橡皮乳头）清洗、包装和灭菌,1. 操作方法1.1 收集每次用后的橡胶制品先在清水中浸泡5h以上，避免附着物干涸。1.2 取出橡胶制品，在2%NaOH溶液中煮沸1020mi
16、n，以除掉可能残留的蛋白质。1.3 佩戴塑料手套取出碱液中的橡胶制品，自来水充分冲洗后，1%稀盐酸浸泡30min。,橡胶制品（胶塞、胶管、橡皮乳头）清洗、包装和灭菌,操作方法1.4 自来水冲洗510次后用三蒸水润洗35次，晾干后准备灭菌。如果是新购置的橡胶制品，往往先用自来水简单冲洗后，在0.5mol/LNaOH溶液中煮沸15min，自来水充分洗涤后再于2%5%盐酸溶液中煮沸15min，自来水充分冲洗（5次以上）后，再用三蒸水漂洗5次以上，蒸馏水煮沸10min，温箱中晾干后准备灭菌。1.5 将晾干后的橡胶制品放在盒底铺有纱布的铝饭盒中，0.07Mpa，115高压蒸汽灭菌20min后于储物柜中存放。,橡胶制品（胶塞、胶管、橡皮乳头）的清洗、包装和灭菌,1. 操作方法2. 注意事项2.1 因胶塞使用面常沾有洗涤剂，流水冲不净，古胶塞洗刷的重点部位是胶塞使用面，用刷逐个刷洗。2.2 在使用过程中，胶塞不能与培养液接触，以防未洗净的胶塞污染培养液和细胞。,
