1、输血相关传染病检测技术概 述,甘肃省平凉市中心血站实验室 吴 宏 涛,输血相关传染病种类,病毒性肝炎 乙、丙、丁、庚型肝炎艾滋病梅毒巨细胞病毒EBV感染HTLV感染（美国、欧盟及我国的厦门血站开展） 疟疾弓形体病等,输血相关传染病检测方法,酶联免疫吸附试验ELISA*免疫荧光法IFA放射免疫法RIA免疫印迹法WB*重组免疫印迹法RIBA颗粒凝集实验PA病毒检测VT病毒核酸检测NAT*,酶联免疫吸附试验ELISA,建于1971年。开创了运用酶标记免疫技术进行液体标本中微量物质的测定，是检验医学的里程碑式的发展。特点：敏感性高，特异性强，操作简便，即可测定抗原，也可测定抗体。类型：间接法，直接法，
2、双抗体夹心法，竞争抑制法或竞争法。,免疫荧光法IFA,荧光抗体技术荧光抗原技术原理： 以特异抗原抗体反应为基础，利用荧光素作为标记物标记已知抗原（或抗体），在一定条件下与被测标本中相应的抗体（或抗原）结合，形成抗原抗体复合物，此时荧光素起示踪物作用。再通过有紫外光源的荧光显微镜就可以辨认出特异性抗原抗体复合物的存在。,放射免疫法RIA,一种用放射性同位素为标记物的免疫学测定方法，具有很高的敏感性与特异性。其原理与ELISA大致相同，所不同的是用放射性同位素为标记物而不是用酶为标记物。,免疫印迹试验WB,又名蛋白印迹试验，其原理是在病毒裂解后将不同分子量的病毒蛋白经十二烷基硫酸钠（SDS）聚丙烯
3、胺凝胶电泳（PAGE）分离后，经过电转移将凝胶上的蛋白条带转移到位硝酸纤维素膜上，以此作为抗原进行病毒特异性抗体检测。,重组免疫印迹试验RIBA,原理：应用重组蛋白或合成肽（而不是直接应用病毒裂解的蛋白）以条带形式吸附在硝酸纤维素膜条上，当条上加入被测血清标本温育后，如果标本中含有特异性抗体时，则和相应抗原带结合形成抗原抗体复合物。通过洗涤，去掉未结合的血清，然后加入酶标IgG二抗，再温育，则酶结合物就结合到抗原抗体复合物上，再洗涤，加入底物。,颗粒凝集试验PA,是一种简便快速的筛检试验，其原理为病毒裂解物或重组抗原包被于颗粒载体（红细胞，乳胶颗粒，明胶颗粒），使之成为致敏颗粒，再加入血清标本
4、，如被测血清中含有特异性抗体，则因抗体与抗原间桥联作用，使致敏颗粒发生凝集。,病毒检测VT,可通过病毒的分离和培养后进行。培养可通过动物培养，鸡胚培养和细胞培养进行，其中以细胞培养方法最敏感、经济和最有前途。病毒感染细胞后，多数病毒能引起病变，可直接镜检观察，或通过血清学检查作出鉴定。,病毒的核酸检测NAT,病毒核酸分子杂交聚合酶链反应PCR,乙型肝炎的检测技术,1 乙肝病毒的生物学性状,形态与结构基因结构与复制方式抗原组成动物模型与细胞培养抵抗力,1.1 HBV形态与结构,HBV结构为双层球形，直径42nm，具有双层衣壳。,1.2 HBV基因结构与复制方式,HBV的DNA基因较小，仅含约32
5、00个核苷酸，负股DNA核苷酸序列含有4个开放读码框架（OPR）分别称为S、C、P和X区。基因及其编码的抗原：S区基因 C区基因 P区基因 X区基因 S基因HBsAg C基因 HBcAg 前S1 Pre-S1 前C基因 HBeAg DNA多聚酶 HBXAg前S2基因Pre-S2,1.3 HBV抗原的组成,表面抗原HBsAg三种形态 小球型颗粒、管形颗粒、Dane颗粒亚型 各亚型均有共同抗原决定簇，称为a抗原，此外还有2组相互排斥的亚型抗原决定簇（d/y和w/r）。按不同的组合方式构成HBsAg四个基本亚型，即adr,adw,adr,ayw。亚型的分布有明显的地区差异和种族相关性，汉族以adr，
6、少数民族为ayw，欧美以adw占优势，ayw主要分布在北非和西非。乙肝ELISA诊断试剂的标准要求adr,adw, ayw三个亚型的最小检出量为0.5ng/L。核心抗原HBcAg为内衣壳部分，不易在血循环中检测，抗原性强。e抗原HBeAg病毒复制和具有强感染性的指标。,1.4 HBV动物模型与细胞培养,黑猩猩是对HBV最敏感的动物。目前采用的细胞培养系统是病毒DNA传染系统。将病毒DNA导入肝癌等细胞后，病毒可整合并复制，在细胞中表达HBV抗原。,1.5 HBV抵抗力,HBV 的抵抗力较强，在30-32可存活6个月，在-20可存活15年，对低温、干燥、紫外线均有耐受。不能被70%乙醇灭活，因此
7、不能用这一常规方法来消毒。但6510 小时 、煮沸10 分钟 或高压蒸气均可灭活HBV。含氯制剂、环氧乙烷、戊二醛、0.5%过氧乙酸和碘伏等也有较好的灭活效果。 消毒可以使HBV失去传染性，但是HBsAg的抗原性仍可保留。,1.6 HBV markers during early infection,InfectionDay 0HBV DNAVariable, up to 31 days prior to HBsAg by ID NAT( 9-11 days by MP NAT) HBsAgDay 59; disappears Day 120,Infection,120,InfectionDa
8、y 0HBV DNAVariable, up to 31 days prior to HBsAg by ID NAT( 9-11 days by MP NAT) HBsAgDay 59; disappears Day 120,Infection,2 乙型肝炎病原体检测,病毒直接标志物病毒抗原：HBsAg、HBeAg、Pre-S1、Pre-S2病毒核酸：HBV DNA间接性标志物抗病毒抗体：HBsAb、HBeAb、HBcAb,2.1乙肝抗原抗体的检测及结果分析,HBsAg 阳性表示HBV 感染;抗-HBs 为保护性抗体;HBeAg阳性可作为HBV 复制和传染性高的指标;抗-HBe 阳性表示HBV
9、 复制水平低(但有前C 区突变者例外) ;抗-HBc 总抗体主要是抗-HBc IgG,只要感染过HBV ,无论病毒是否被清除,此抗体均为阳性;抗-HBc IgM 阳性提示HBV 复制,多见于乙型肝炎急性期。近些年有许多实验室开展了乙肝前S1 抗原检测,前S1 抗原在病毒感染、装配、复制和刺激机体产生免疫反应等方面起着十分重要的作用,被认为是比HBeAg 更敏感的病毒复制标志,尤其适合无条件开展HBV DNA 检测的医疗单位。微粒子酶免分析法(MEIA) 及化学发光法虽然灵敏度更高, ,但由于价格昂贵并未能广泛开展。HBV 血清学标志物检测技术的发展趋势是从定性检测转变为定量分析。HBV 血清学
10、标志传统上包括HBsAg、抗-HBs、HBeAg、抗-HBe、抗-HBc 和抗-HBc Ig M。,2.2 HBV DNA 及其基因型、变异和cccDNA 的检测1,HBV DNA 检测HBV DNA 定性和定量检测反映了病毒复制情况或水平,主要用于慢性HBV 感染的诊断、血清HBV DNA 水平的监测,以及评价抗病毒疗效,多使用各种PCR 技术。基因型和变异的检测HBV 病毒可分为8 型,分别为A、B、C、D、E、F、G、H。HBV 基因分型常用的方法有:多重PCR 法;限制性片段长度多态性分析法;线性探针反向杂交法;全基因序列测定法等。全基因序列测序分型的结果准确性高,尤其是能发现两种不同
11、基因型的重组体感染,被公认为HBV 基因分型的金标准,但比较昂贵繁琐,不适合常规应用。目前的研发趋势是针对有重要临床意义的HBV 变异进行快速、定量的多位点联合检测。,2.2 HBV DNA 及其基因型、变异和cccDNA 的检测2,cccDNA（共价闭合DNAcovalent closed circular） 的检测cccDNA 是HBV 的原始复制模板,对乙肝病毒的复制及感染状态的建立具有十分重要的意义。Southern blot 是检测HBV cccDNA 的经典方法,但是该方法过程比较复杂,而且灵敏度不高。实时荧光定量PCR 不需对PCR 反应产物进行开盖检测,从而减少了PCR 产物污
12、染的可能 ,可对cccDNA 进行定量分析,多被实验室采用。,2.3 乙肝病毒微生物学检查法,HBV感染宿主的免疫学监测HBV 感染的病程很大程度上取决于宿主的免疫机能,不同病程时期的机体免疫特点、体内病毒水平和肝脏损伤程度均不相同,临床免疫学检测对HBV 感染的各病程阶段的免疫状态判断、指导治疗和评价疗效等方面都有重要的意义。流式细胞仪可以同时准确检测几种T淋巴细胞亚群的数量,监控病人的免疫状态,被实验室广泛应用。,3 乙肝诊断试剂的研制进展,抗-HBs诊断血清血凝试验 反向被动血凝试验 RPHA 被动血凝试验PHA放射免疫试验RIA酶联免疫测定法（ELISA）试剂DNA聚合酶链反应PCRH
13、BsAg全血金标检测试纸条,4 检测乙肝时常见问题1,阳性漏检的问题一步法试剂的钩端效应，后带现象。试剂的标准中对一步法试剂有3份1：64效价的HBsAg阳性血清，检测结果要求为阳性。灵敏度：灵敏度对于早期检出有利。窗口期：美国研究表明90%的HBsAg漏检是因为窗口期。国内研究表明30%40%是因为窗口期。亚型问题ad型检出率要高于ay型变异HBsAg变异类型有很多，5070变异 株与抗野生株单抗的免疫反应减弱或消失。 有部分变异株与野生株在立体构型和抗原反应性上有明显的差异 ,因此防治困难。,4 检测乙肝时常见问题2,乙肝假阳性问题类风湿因子RF与抗体结合，造成ELISA和金标法的假阳性。
14、补体与IgG的Fc段结合，造成ELISA和金标法的假阳性。纤维蛋白原与酶结合物粘附于微板上洗不掉，造成ELISA假阳性。稀释液推进剂，金标法中应先加样品，后加释释剂，否则易出现假阴性。,丙型肝炎的检测技术,1 丙肝病毒的生物学性状,形态与结构基因结构与功能丙肝病毒抗体的特点与临床意义丙肝病毒感染后ALT特点与意义丙肝病毒的生物学检测,丙肝病毒简介,1974年Golafield首先报告输血后非甲非乙型肝炎。1989年Choc等应用分子克隆技术获得本病毒基因克隆，并命名本病及其病毒为丙型肝炎（HepatitisC）和丙型肝炎病毒（HCV）。由于HCV基因组在结构和表型特征上与人黄病毒和瘟病毒相类似
15、，1991年， 国际病毒命名委员会(ICTV)将其归为黄病毒科丙型肝炎病毒属。,1.1 形态与结构,HCV病毒体呈球形，直径小于80nm（在肝细胞中为36-40nm，在血液中为36-62nm），为单股正链RNA病毒，在核衣壳外包绕含脂质的囊膜，囊膜上有剌突。HCV体外培养尚未找到敏感有效的细胞培养系统，但黑猩猩对HCV很敏感。,1.2 HCV基因结构与功能,丙型肝炎病毒是单股正链RNA病毒其基因组含有一个大约9033个核苷酸构成的大开放读码框(0RF)，可编码30103033个氨基酸的多蛋白前体，多蛋白N端的14依次为核心蛋白(c)和包膜蛋白(El和E2)等结构蛋白，其余依次为NS2、NS3、
16、NS4和NS 5等非结构蛋白 ，膜蛋白分布于病毒表面，NS3蛋白具有蛋白酶的功能，NS5蛋白为一依赖于RNA的RNA多聚酶,1.3 HCV抗体的特点与临床意义,1 抗核心区抗体抗-C22-3核心区抗体，核心区基因保守性强，其抗体出现较早（感染后8-10周），持续时间长，与HCV RNA高度相关，其血液有较大的传染性。抗-HCe被膜区抗体，被膜区基因（E1，E2/NS1）变异程度高，其抗体可用于血清学分型，用于感染的流行病学研究。,1.3HCV抗体的特点与临床意义,2 抗非结构区抗体抗-C33C 编码C33C多肽的基因位于NS3中区，与HCV的复制有关，用于HCV感染检测，抗-C33C 与抗-C
17、22-3同时或稍早出现，两者对HCV感染具有互补作用，但不能相互替代。抗-C100-3 C100-3多肽编码基因位于NS4区，从感染后4-32周出现，最长可达1年以上，对感染早期诊断意义不大，在鉴别急性、慢性感染和判断上有一定价值。但假阳性比例较高，血清中类风湿因子，过氧化物歧化酶、球蛋白、自身抗体等与多肽呈低亲和结合；标本放置过长或反复冻融也可出现假阳性。抗-NS5 抗-NS5 持续阳性者，ALT多明显升高，而持续阴性者，ALT多正常或轻度升高，与疾病活动相关。IgM抗体 先于IgG抗体出现，对感染早期诊断及急、慢性感染具有重要意义。 HCV感染后标志物出现的次序：HCV RNA（2周）AL
18、T （4周）抗体-NS5 （6周）抗-C22-3 （7周）抗-C33C （8周）抗-C100-3 （9周）,1.4丙肝感染后标志物的产生,2 丙肝病毒微生物学检查法,酶联免疫吸附实验ELISA放射免疫测定法RIA重组免疫印迹实验（确认实验）血清HCV RNA检测双抗体夹心法测HCV病毒抗原,2.1丙肝抗体ELISA检测,第一代抗-HCV试剂盒 采用的抗原C100-3 是HCV非结构基因(NS3NS4)和人超氧化物歧化酶基因嵌合后表达的融合蛋白，灵敏度低，漏检率较高；第二代抗-HCV试剂盒 在第一代基础上增加了核心区重组蛋白C22-3和NS3区重组蛋白-C33C，虽然在灵敏度和特异忡上有很大改善
19、，但仍不能排除由于重组融合蛋白带来的少数假阳性和极少数的漏检 。第三代抗-HCV试剂盒 其包被抗原为HCV核心抗原、NS3、NS4和NS5抗原，特异性超过99，虽然目前缺乏判断其敏感性的金标准，但对于免疫功能正常的HCV RNA阳性感染者， 抗一HCV检出率也高于99。,2.2丙肝病毒核酸RNA的检测,HCV RNA检测包括定性和定量两种，定性PCR的灵敏度高于定量PCR，因此定性PCR主要用于急慢性丙型肝炎诊断，而定量PCR则用于疗效监测但该方法在技术和设备上要求较高，且费时，检出率较低，主要原因是：HCV在血液和肝组织中的感染滴度很低，且有一定波动：HCV RNA易被血细胞中的RNA酶降解
20、，因此如果被检标本保存不当(例如反复冻融)将影响检测结果：HCV RNA还受进食的影响，易与血中脂质及脂蛋白结合，降低检出率：另外，RT-PCR的多步骤实验中任何步骤的问题均易影响其检出该方法也容易因污染而出现假阳性。为了使HCV RNA的规范化检测：对患者在空腹条件下抽血，及早分离血清和进行检测，避免对标本反复冻融，PCR的整个过程应避免RNA酶及DNA酶对标本的降解和对模板的污染。,2.3丙肝病毒核心抗原的检测,HCV核心抗原的检出比抗一HCV的检出约早49 d，用双抗体夹心法定性或定量检测血清样品中总的或游离的HCV核心抗原，方法简单、时间短、对环境要求低以及假阳性率低的特点。用途：可用
21、于HCV血清学转换前的早期急性丙型肝炎诊断、抗一HCV阳性感染者的病毒血症分析以及HCV感染者治疗前后病毒血症追踪分析等。局限性：由于方法敏感性的限制，HCV RNA水平低于20 000 kTUL时不适用。,3检测丙肝时常见问题,假阳性比较高HCV基因组的变异较大血清中抗-HCV出现较晚不同厂家的试剂对同一标本检验结果存在差异,梅毒螺旋体的检测技术,1 梅毒螺旋体的生物学性状,形态结构与染色培养特性抵抗力梅毒螺旋体抗体抗TP抗体抗心磷脂抗体，称反应素,基本概念,1.病原性螺旋体（Spirochetes）：是一群细长而柔软、波状或螺旋状，运动活泼的原核细胞微生物。主要有钩端螺旋体，梅毒螺旋体，雅
22、司螺旋体和回归热螺旋体等。2 .梅毒螺旋体（Treponema pallidum）学名苍白密螺旋体，梅毒病原体，对人有致病性的密螺旋体中最重要的一种。,1.2 TP形态结构与染色,TP直径0.1-0.2微米，长6-15微米，有8-14年致密而规则的螺旋，两端尖直，运动活泼。电镜下菌体内为轴丝，最外层为外膜，其内为胞质膜，二者之间为鞭毛样结构。菌体有蛋白质、类脂及糖类，外膜蛋白质中P47和轴丝P37抗原具有高度免疫原性，在免疫学诊断和预防中可能起重要作用。TP用普通染料不易着色；病灶取材直接检查，可用不染色新鲜标本在暗视野显微镜下观察形态和运动方式。,1.3TP培养特性,人工体外培养尚未成功。毒
23、力株螺旋体能在家兔部分组织中繁殖，并保持其对人及家兔的致病力，但因其分裂繁殖缓慢，30-33小时才能分裂1次。,1.4TP抵抗力,梅毒螺旋体抵抗力极弱，对温度和干燥特别敏感，离体后干燥1-2小时；血液中4放置3天；加热50 5分钟即灭活；对化学消毒剂亦敏感，对青霉素、四环素、红霉素或砷剂敏感。,1.5梅毒螺旋体抗体,1、抗TP抗体（P15，P17，P47）当补体存在时，可将螺旋体杀死或溶解，也对吞噬细胞发挥调理作用。在梅毒潜伏期即产生，一期梅毒时增高，主要是IgM型，二期梅毒时达到高峰，有IgG和IgM型，三期梅毒略降低，主要是IgG型，但不是保护性抗体，晚期梅毒或治疗后仍保持阳性。2、抗心磷
24、脂抗体，称反应素reagin。同生物组织中的脂质发生反应，反应素无保护作用，仅可用作梅毒血清学诊断。一期梅毒时增高，二期梅毒时达到高峰，三期梅毒略降低。,1.6TP抗原,主要为外膜蛋白抗原：p47、p45、p17、p15。 p47具有强免疫原性，是梅毒螺旋体的主要优势抗原，与另外两种密螺旋体有交叉反应。 p17也具有梅毒螺旋体抗原特异性，与人类正常血成分无交叉反应。,2梅毒螺旋体检查法,梅毒螺旋体显微镜检查（直接查病原体）主要梅毒血清学检查非密螺旋体抗原试验快速反应素试验RPR甲苯胺红不加热血清试验TRUST不加热血清反应素玻片试验USR密螺旋体抗原试验酶联免疫吸附实验ELISA梅毒螺旋体血凝
25、集试验TPHA荧光密螺旋体抗体吸收试验FTA-ABS金标快速试纸条法,2.1梅毒螺旋体检测方法的评价,RPR：用于普查，适用于一、二期梅毒反应素检测，有假阳性。FTA-ABS适用于诊断各期梅毒，敏感性和特异性都很高，狼疮病有假阳性反应。TPHA：敏感性和FTA-ABS相似，但特异性更高。不用于一期诊断，结缔组织病、麻风等可出现假阳性。WB：能检出其四种特异性抗体，作为确认试剂有较强的可靠性；ELISA：灵敏度和特异性好；TRUST：同时存在较高的假阳性及假阴性问题。,3检测梅毒时常见问题,生物学真阳性反应密螺旋体属的螺旋体均具有与梅毒螺旋体完全一样的类脂质抗原，产生的反应素的生物学性状与梅毒一
26、样。生物学假阳性反应其他非密螺旋体疾病的病原体和其他致病因素所引起的反应素反应，如：疟疾、斑疹伤寒、猩红热、乙肝、麻风、红斑狼疮等。人为假阳性反应采集标本过程中注射器上有类脂质，标本运输保存不当，血液游离出脂肪酸，人血白蛋白增高等；试剂中胆固醇含量增高；检验人员技术水平和判断误差；反应时间过长。,艾滋病的检测技术,1 艾滋病毒的生物学性状,形态与结构基因结构与功能病毒复制培养特性抵抗力HIV感染的免疫应答,HIV,HIV基因组包括了逆转录病毒所共有的3个基因和6个调节蛋白基因以及5LTR(long terminal repeat 长末端重复序列)3LTR，它们从左至右分别为： gag，pol，
27、调节蛋白，env的顺序排列,HIV,gag基因编码的核心多肽有4个主要部分：p25和p24、p7、p9、p17，其中p24的特异性最高。,HIV,env基因编码糖基化的前体gp160。该蛋白后来分为gp120和gp41。gp120为最外包膜上的糖蛋白，gp41为跨膜蛋白。pol基因编码病毒复制所需酶。HIV的免疫诊断使用的抗原决定簇包括：gp41的包膜外侧区段。另外gp36为HIV II型特异性包被抗原片断。,HIV Viremia during early infection,11,16,22,Ramp-up viremiaDT = 21.5 hrs,p24 Ag EIA -,HIV MP-
28、NAT -,HIV ID-NAT -,Peak viremia: 106-108 gEq/mL,“blip” viremia,Viral set-point: 102 -105 gEq/mL,艾滋病实验室检查法,HIV1/2抗体检测（包括筛查和确证试验）酶联免疫吸附实验ELISA快速试纸条明胶颗粒凝集试验PA蛋白印迹实验WB,艾滋病实验室检查法,病毒载量检测逆转录PCR系统RT-PCR核酸序列依赖性扩增技术NASBA分枝DNA信号放大系统bDNACD4+T淋巴细胞检测,艾滋诊断试剂的研制进展,第一代抗-HIV试剂盒第二代抗-HIV试剂盒第三代抗-HIV试剂盒第四代抗-HIV试剂盒,检测艾滋时常见问题,假阳性结果假阴性结果确证不确定结果拖带污染,
