1、1硝化细菌的分离与鉴定要筛选生长速度快、硝化作用强的硝化细菌用于水产养殖水处理。硝化细菌包括亚硝化 菌和硝化菌两个生理菌群，分别可将水中的氨态氮转化为亚硝酸盐和硝酸盐。实验结果 表明经 5 周培养，亚硝化菌可使培养液中的氨氮含量下降到 60，硝化菌可使培养液中的 亚硝酸盐含量下降到 60。实验可通过测定培养液中亚硝酸盐的含量变化来测定细菌的 氨转化作用或硝化作用。 关键词：硝化菌，亚硝化菌，硝化作用，筛选。 氨氮和亚硝酸盐都是在水产养殖过程中产生的有毒物质，且亚硝酸盐还是强烈的治癌物 质，因此如何降解这两种物质，是科学工作者近年来的工作重点。 硝化细菌是一类具有硝化作用的化能自养菌，包括硝化菌
2、和亚硝化菌两个生理菌群，其 主要特性是自养性，生长速率低，好氧性，依附性和产酸性等。可通过 NH4+ NO2- NO3-这一过程将 NH4+转化为 NO3-。能有效降低水体中氨氮及亚硝酸氮的含量，对水产养 殖业及环境保护具有重要意义。硝化细菌是生物硝化脱氨中起主要作用的微生物，直接 影响硝化效果和生物脱氨的效率。 研究表明，水体中硝化细菌的浓度对生物脱氨具有十分重要的意义，由于大多数硝化细 菌生长缓慢，硝化及脱氨效果欠佳，处理水产养殖污水的效果不是很好。因此筛选出生 长速率高硝化作用强度大的硝化细菌有很大的用途。 本文对硝化细菌的研究主要在富集培养和固定化细胞方面，能够有效提高硝化细菌的产 率
3、和硝化细菌的利用率。通过富集培养的硝化细菌浓度是未经富集培养的 12.520.0 倍 ，利用细胞固定化技术可使氨氮去除率提高 16.5 个百分点。国外在硝化细菌的培养方面 的研究已有一些专利技术，其中一些已形成工业化生产，但产品价格较昂贵，并且必须 不断向反应器中补充流失的硝化细菌。硝化作用包括两个步骤：氨转化为亚硝酸盐和亚 硝酸盐转化为硝酸盐，这两个步骤分别由亚硝化菌和硝化菌完成，至今还未发现有能将 氨直接转化为硝酸盐的细菌。 氨和亚硝酸分别是亚硝化菌和硝化菌的唯一能源。对于硝化细菌来说生长环境中的温度 对其影响较大，pH 值和盐度的影响相对较小。大多数硝化细菌的合适生长温度为 1038 2
4、，高于 20时硝化细菌的活性较高，但超过 38消化作用将会消失。当环境气温低于 20时，氨的转化会受到影响。 一般认为，适宜硝化菌和亚硝化菌生长介质的 pH 值分别为 6.08.5 和 6.08.0。水体 DO 的高低影响到好氧、厌氧微生物的比例，大多数研究人员认为 DO 的浓度应当控制在 1.0 2.0 mg/L，低于 0.5 mg/L 时硝化作用明显减弱。另外，碳氮比、碱度等对硝化及脱氨均 有影响。 本文中筛选硝化细菌的依据主要是生长速率和硝化作用强度，生长速率主要采用活菌计 数，因为硝化细菌的液体培养基中有沉淀，用 OD600 测的值误差较大。氨转化效率和硝化 作用强度主要用比色法测定，
5、利用亚硝酸根的显色反应。亚硝化菌测定其培养液中亚硝 酸根的增加量，硝化菌测定其亚硝酸根的减少量。 1 材料和方法 1.1 实验材料 1.1.1 菌种 由海洋中分离得到 1.1.2 培养基 亚硝化菌培养基 (NH4)2SO4 0.5g NaCl 0.3g FeSO47H2O 0.03g K2HPO4 1g MgSO47H2O 0.03g CaCl2 7.5g 蒸馏水 1000ml PH 自然固体培养基加 5琼脂 硝 化菌培养基 NaNO2 1g MgSO47H2O 0.03g MnSO44H2O 0.01g K2HPO4 0.75g Na2CO3 1g NaH2PO4 0.25g 蒸馏水 100
6、0ml PH 自然固体培养基加 5琼脂 肉汤培 养基牛肉膏 0.5蛋白胨 1氯化钠 0.5琼脂 2 1.1.3 试剂 牛肉浸膏 上海长阳生化制药厂蛋白胨 上海东海制药厂磷酸氢二钾 浙江临平化工试剂厂 磷酸二氢钠 南京化学试剂一厂磷酸氢二钠 南京化学试剂一厂氯化钠 南京化学试剂一厂 MnSO44H2O 南京化学试剂一厂琼脂 江苏疾病预防控制中心微生物试剂厂（NH4） 2SO4 南京化学试剂一厂 FeSO47H2O 上海试剂二厂 MgSO47H2O 上海试剂 四厂 CaCl2 华东师范大学化工厂 Na2CO3 上海虹光化工厂 NaNO2 淮安化工二厂磺胺酸 天津瑞金特化学品有限公司 -萘胺 上海泗
7、联化工厂 31.2 实验方法 1.2.1 硝化细菌的分离 将采集到的海水样本分别放在两个培养皿中，分别加入亚硝化菌液体培养基和硝化菌液 体培养基，放在 24地培养箱中培养 5 天，然后取培养液在固体培养基上进行分区划线， 得到单菌落，再挑取单菌落进行分区划线分离。 1.2.2 形态结构鉴定 （1）将分离得到的单菌落分别接种到肉汤培养基的平板上看其是否生长（硝化细菌是严 格的自养菌，在肉汤培养基上不能生长）。 （2）镜检观察：单染色法 （3）在培养液中加入格利斯试剂，亚硝化菌培养液变红即可判断为阳性，硝化菌的培养 液需比色计算出其亚硝酸根浓度是否降低，才能判断是否为硝化菌。 1.2.3 细菌的培
8、养（摇瓶、发酵罐） （1）摇瓶培养：将初步鉴定是硝化细菌的菌落接种到摇瓶中 20-28培养，200 转/分钟 ，每隔五天取样一次测硝化作用强度和菌浓度。 （2）发酵培养：将培养 5 天的种子加入发酵罐中，于 20-28培养，其中 pH 控制在 6.0 以 上。每隔 12 小时取样测亚硝酸根浓度和菌浓度。 1.2.4 硝化作用测定 1.2.4.1 试剂 （1）格利斯试剂溶液：称取磺胺酸 0.5g，溶于 150ml 醋酸溶液（30）中，保存于棕 色瓶中。 溶液：称取 -萘胺 0.5g，加入 50ml 蒸馏水中，煮沸后，缓缓加入 30的醋 酸溶液 150ml 中，保存于棕色瓶中。 （2） 2%醋酸钠
9、溶液 将 2g 无水醋酸钠加入到 100ml 蒸馏水中，混匀溶解。 1.2.4.2 方法 标准曲线的绘制 称取 4.500g 分析纯亚硝酸钠于干燥的小烧杯中，加蒸馏水溶解后洗入 100ml 容量瓶中， 加蒸馏水至刻度定容，摇匀，溶液中 NO2-的浓度为 30mg/ml，用时稀释至 NO2-为 0.03 mg/ml。 4吸取 NO2-标准液（NO2-0.03 mg/ml）0、1、2、3、4、5 ml，分别放入 50 ml 容量瓶中 ，每一容量瓶 NO2-浓度为 0、0.6、1.2、1.8、2.4、3.0g/ml；各加入 1 ml 格利斯试剂 ，放置 10 分钟，再加入 1 ml 格利斯试剂和 1
10、ml2醋酸钠溶液，显色后稀释至刻度。 用分光光度计于 520nm 处比色，以浓度为横坐标，以光密度值为纵坐标绘制标准曲线。 培养液中 NO2-测定 亚硝化菌氨转化作用测定 取 1 ml 培养液于 50 ml 容量瓶中，加入 1 ml 格利斯试剂， 放置 10 分钟，再加入 1 ml 格利斯试剂和 1ml2醋酸钠溶液，显色后稀释至刻度。用分 光光度计于 520nm 处比色。 硝化菌硝化作用强度测定 取 1 ml 培养液稀释 100 倍（视培养液中 NO2-浓度而定），取 稀释后的培养液 1 ml 于 50 ml 容量瓶中，加入 1 ml 格利斯试剂，放置 10 分钟，再加入 1 ml 格利斯试剂
11、和 1ml2醋酸钠溶液，显色后稀释至刻度。用分光光度计于 520nm 处比色 。 结果计算 标准曲线以浓度为横坐标，以光密度值为纵坐标绘制标准曲线。回归得到方程 y=ax+b 亚硝酸根浓度= ，mg/ml d=稀释倍数 1.2.5 细菌浓度测定 （1）取 0.1ml 培养液加到 0.9ml 生理盐水中，混匀，就得到 101 的菌悬液，再取出 0.1ml 加到 0.9ml 生理盐水中，得到 102 的菌悬液，同样方法依次稀释到 103、104 的菌悬 液，具体情况视菌悬液浓度而定。 （2）将稀释好的菌悬液取 0.1ml，与冷却到 50的琼脂培养基混匀，于 24培养 5 天，进 行计数。 2 结果
12、 2.1 亚硝酸盐浓度测定标准曲线用亚硝酸根标准液，加入格利斯试剂，于 752 分光光度计 上 520nm 处比色，以亚硝酸根浓度为横坐标，A 值为纵坐标，绘制标准曲线。见图 1。 图 1 亚硝酸盐浓度测定的标准曲线 Fig 1 The standard curve of nitrite detection 2.2 硝化细菌的鉴定 2.2.1 形态结构鉴定单染色法经单染色法观察，亚硝化菌为椭圆形球菌，体积较大； 5硝化菌体积较小。与文献所述相同。见图 2 和图 3。 图 2 亚硝化菌的形态 Fig 2 The morphology of sub-nitrobacteria 图 3 硝化菌的形态
13、 Fig 3 The morphology of nitrobacteria 2.2.2 培养特征将挑选出来的菌落接种到肉汤琼脂培养基上，没有生长，可以认为该菌 为自养菌。（硝化细菌是严格的自养菌不能在肉汤培养基上生长） 2.2.3 硝化作用鉴定将亚硝化菌和硝化菌接种到液体培养基中，于 24培养 5 天，在亚硝 化菌的培养液中加入格利斯试剂，溶液变红可以判断为亚硝化菌；将硝化菌的的培养液 取出 1ml 稀释 100 倍，加入格利斯试剂，于 752 分光光度计上比色，看其中的亚硝酸根含量 减少，可以断定为硝化菌。 2.3 氨转化作用和硝化作用 2.3.1 亚硝化菌的氨转化作用亚硝化菌经过 5 周
14、的摇瓶培养能使培养液中亚硝酸根的浓度 能上升到 300 l/ml 以上，说明其具有亚硝化作用。实验结果见图 4。 图 4 亚硝化菌的 氨转化作用 Fig 4 The ammonia conversion of sub-nitrobacteria 2.3.2 硝化菌的硝化作用硝化菌经过 10 天左右的发酵培养可使发酵液中的亚硝酸根浓度 下降 40左右。实验结果见图 5。 图 5 硝化菌的硝化作用 Fig 5 The nitrification of nitrobacteria 2.4 硝化细菌的培养 2.4.1 发酵培养硝化细菌的 pH 值变化由于硝化细菌产酸，发酵罐中的 pH 值一直呈下降的
15、趋势，但是由于酸性环境不利于硝化细菌的硝化作用，所以 pH 值最好控制在 6.0 以上。实 验结果见图 6。 2.4.2 发酵培养硝化细菌溶氧的变化硝化细菌是一种好氧的自养菌，由于硝化细菌生长 速度缓慢，发酵液中的菌浓度一直较低，因此溶氧一直较高，最低时也有 68左右。在 发酵后期随着菌体的自溶，溶氧还有上升的趋势，实验结果见图 7。 图 6 发酵罐培养硝 化细菌的 pH 值变化曲线 Fig 6 The pH curve of nitrobacteria cultivation in fermenter 图 7 发酵罐培养硝化细菌的 DO 值变化曲线 Fig 7 The DO curve of
16、 nitrobacteria cultivation in fermenter 2.4.3 发酵培养硝化细菌的生长曲线该生长曲线由发酵液活菌计数得到，横坐标为发酵 6时间，纵坐标为含菌量的对数值。由该生长曲线可以看出硝化细菌和一般的异养菌的不 同，硝化细菌的生长较缓慢，其对数生长期要 5 天左右才能到达，菌浓度也很低。实验结 果见图 8。 图 8 发酵培养硝化细菌的生长曲线 Fig 8 The growth curve of nitrobacteria 3 讨论 3.1 本研究的主要目的是筛选生长速度快、硝化作用强度大的硝化细菌。主要步骤如下 ：采集水样 分离 鉴定 培养 硝化作用测定 菌种保
17、存 发酵培养 细菌浓度测定 3.2 测定硝化作用强度的原理是：NO2-能与格利斯试剂反应生成紫红色化合物，此反应 不受 NO3-N 的干扰。因此可通过比色测定出培养基中亚硝酸的含量。 3.3 在摇瓶培养和发酵培养的后期，菌的亚硝化率和硝化率都有所下降，可能的原因是 培养液中的产物累积的太多，对亚硝化作用和硝化作用有抑制，特别是硝酸根对硝化作 用的抑制，因此，对于硝化细菌最好采用连续培养。总之，随着水产养殖业的迅速发展 ，硝化细菌已逐渐成为水产养殖界的热门话题，它在水产养殖中的重要作用已引起广泛 的关注，可以说，启今日为止，在大规模、集约化的水产养殖模式中，如果没有硝化细 菌参与其中的净水作用，想获得成功的养殖，几乎是不可能之事。硝化细菌作为生物硝 化脱氨的主要微生物，由于其生长速率低，要想提高硝化细菌的工作效率，一方面要避 免硝化细菌的流失，一般可做成固定化细胞，还有就是要富集培养，此外，对催化硝化 细菌的酶也可以进行更多的研究。对硝化细菌的研究在这几方面还大有作为。
