1、对返排液杀菌效果的测试方法实验原理：推测返排液主要的细菌为硫酸盐还原菌、铁细菌和腐生菌。通过加入不同杀菌剂，测量加入前后细菌含量，得出不同杀菌剂的杀菌率，优选效果最好的杀菌剂。实验仪器：1) 硫酸盐还原菌（SRB）测试瓶；2) 铁细菌（IB）测试瓶；3) 腐生菌（TGB）测试瓶；4) 注射器：1ml；5) 恒温培养箱；6) 电热消毒器。实验步骤：1) 将测试瓶排成两组，并编号；这是二次重复法，三次重复法方法类似，不过要把测试瓶分为三组。2) 用 120消毒 20min 的无菌注射器取 1.0ml 水样注入第一组 1 号瓶内，充分震荡；3) 用另一只无菌注射器从第一组 1 号瓶中取 1.0ml
2、水样注入第一组 2 号瓶；4) 再更换无菌注射器从第一组 2 号瓶取 1.0ml 水样注入第一组 3 号瓶；5) 以此类推一只稀释到最后一瓶为止。根据细菌含量决定稀释瓶数，一般稀释到 7 号瓶；6) 将杀菌剂加入到所测试的水样，用无菌注射器去 1.0ml 杀菌后的水样注入到第二组 1号瓶内；7) 用另外一只无菌注射器从第二组 1 号瓶去 1.0ml 水样注入第二组 2 号瓶；8) 以此类推。根据细菌含量决定稀释瓶数，一般稀释到 7 号瓶；9) 将上述测试瓶放入放入恒温培养箱中培养，温度控制在 37，7d 后读数；10) 用下列公式计算杀菌率：=121100%Y杀菌剂的杀菌率，%；B1加杀菌剂前
3、水样中细菌含量，个/ml;B2加杀菌剂后水样中细菌含量，个/ml。备注：一、注意事项1) SRB 测试瓶变黑或者有黑色沉淀，表示有硫酸盐还原菌；TGB 测试瓶由红变为黄或浑浊，表示有腐生菌；IB 测试瓶出现棕红色沉淀，表示有铁细菌。2) 杀菌剂的加量为 50mg/L;3) 在室温下向水样注入杀菌剂，杀菌时间为 4h；4) 腐生菌的培养时间是 5d7d；铁细菌的培养时间是 7d14d，硫酸盐还原菌的培养时间是 14d21d。5) 测试瓶大概为 3 元/瓶。二、读数方法：1.生长指标的确定原则：1) 全部呈阳性反应的最后一列平行样应为生长指标的第一位数。2) 同一平行样，有 X 个阳性反应瓶，生长
4、指标即为 X。2.级数的确定原则：1) 全部呈阳性反应的最后一列平行样的瓶号数减去 1，即为级数 n，以 10n 表示。2) 1 号瓶的 2 或 3 个平行样未全部发生阳性反应时，级数为 0，即为 100。3.细菌测试瓶测试方法及结果报告示例例：做三个平行样重复试验，每个样稀释 5 个梯度：1 2 3 4 51 2 3 4 51 2 3 4 5即分别在 1、1、1 号瓶中注入 1ml 水样，摇匀后取出 1ml 再分别注入 2、2、2 号，摇匀后取出 1ml 再分别注入 3、3、3瓶中，以此类推直至注入到 5、5、5号瓶。在恒温下放置一段时间后，观察测试瓶阳性（变色）反应个数。即：1+ 2 3
5、4 51+ 2+ 3+ 4 51+ 2+ 3 4 5所以读数为：321；级数：100（1-1=0 ）此生长指标为 321，级数为 100。通过查表可知，321 对应的细菌量为 15 个/ml，此系列报告结果为：15 100=1500 个/ml 。1+ 2+ 3+ 4+ 5+1+ 2+ 3+ 4 5+1+ 2+ 3+ 4 5此生长指标为 312，级数为 102（3-1=2 ） 。通过查表可知 312 对应的细菌量为 11.5 个/ml。此系列报告结果为：11.5102=1173 个/ml。1+ 2+ 3+ 4+ 5+1+ 2+ 3+ 4+ 5+1+ 2+ 3+ 4+ 5+3 0 0此生长指标为
6、300，级数为 104（5-1=4） 。通过查表可知，300 对应的细菌量为 2.5 个/ml。此系列报告结果为2.5104=2600 个/ml。例子 11 列 2 列 3 列 4 列 5 列+ + + + + + 此生长指标为 321，级数为 100（1-1=0） 。通过查表可知，321 对应的细菌量为 15 个/ml。此系列报告结果为 15100=1500 个/ml。例子 21 列 2 列 3 列 4 列 5 列+ + + + + + + + + + +此生长指标为 311，级数为 2（3-1=2） 。通过查表可知，311 对应的细菌量为 7.5 个/ml 。此系列报告结果为 7.5102
7、=765 个/ml 。例子 31 号瓶 2 号瓶 3 号瓶 4 号瓶 5 号瓶+ + + + + + 此生长指标为 211，级数为 1（2-1=1） 。通过查表可知，211 对应的细菌量为 13 个/ml。此系列报告结果为 13101=1313 个/ml。例子 41 号瓶 2 号瓶 3 号瓶 4 号瓶 5 号瓶 + + + 此生长指标为 111，级数为 0（1-1=0） 。通过查表可知，111 对应的细菌量为 2.0 个/ml 。此系列报告结果为2100=200 个/ml注：a) 做几个平行样对应查几次重复计数表（即生化检测方法中的 MPN 表） 。b) 计算公式为：发生阳极反应瓶号数-1=级
8、数，即在结果后应10n。如 1 号瓶级数为0 级，即在结果后100；2 号瓶级数为 1 级，即在结果后101.c) 如果第一列（1、1、1）未全部发生阳性反应，报告结果应注明“” ；d) 如果至最后一列（5、5、5 ）全部发生阳性反应，报告结果应注明“” ，此情况下说明细菌量大，应增加测试瓶个数以求得较准确的结果。e) 测试瓶注入水样后应用力摇晃，以保证结果的准确性；逐级稀释水样时，应更换无菌注射器，以保证结果的准确性。附录 细菌量统计表1.稀释法三次重复菌量统计见表 1：表 1 稀释法三次重复菌量计数表生长指标 细菌量；个/ml 生长指标 细菌量；个/ml 生长指标 细菌量；个/ml000
9、0.0 201 1.4 302 6.5001 0.3 202 2.0 310 4.5010 0.3 210 1.5 311 7.5011 0.6 211 2.0 312 11.5020 0.6 212 3.0 313 16.0100 0.4 220 2.0 320 9.5101 0.7 221 3.0 321 15.0102 1.1 222 3.5 322 20.0110 0.7 223 4.0 323 30.0111 1.1 230 3.0 330 25.0120 1.1 231 3.5 331 45.0121 1.5 232 4.0 332 110.0130 1.6 300 2.5 333 140.0200 0.9 301 4.02.稀释法二次重复菌量统计见表 2：表 2 稀释法二次重复菌量计数表生长指标 细菌量；个/ml 生长指标 细菌量；个/ml 生长指标 细菌量；个/ml000 0.0 110 1.3 211 13.0001 0.5 111 2.0 212 20.0010 0.5 120 2.0 220 25.0011 0.9 121 3.0 221 70.0020 0.9 200 2.5 222 110.0100 0.6 201 5.0101 1.2 210 6.0
