1、 缓冲液缓冲液是一种能在加入少量酸或碱时抵抗 pH 改变的溶液。 PH 缓冲系统对维持生物的正常pH 值，正常生理环境起重要作用。多数细胞仅能在很窄的 pH 范围内进行活动，而且需要有缓冲体系来抵抗在代谢过程中出现的 pH 变化。在生物体中有三种主要的 pH 缓冲体系，它们时蛋白质、重碳酸盐缓冲体系。每种缓冲体系所占的分量在各类细胞和器官中是不同的。在生化研究工作中，常常要用到缓冲溶液来维持实验体系的酸碱度。研究工作的溶液体系pH 值的变化往往直接影响到我们工作的成效。如果提取酶实验体系的 pH 值变化或变化过大，会使酶活性下降甚至完全失活。所以我们要学会配制缓冲溶液。由弱酸及其盐组合一起使具
2、有缓冲作用。生化实验室常常用的缓冲系主要有磷酸、柠檬酸、碳酸、醋酸、巴比妥酸、Tiris（三羟甲基氨基甲烷）等系统，在生化实验或研究工作中要慎重地选择缓冲体系，因为有时影响实验结果的因素并不是缓冲液的 pH 值，而是缓冲液中的某种离子。如硼酸盐、柠檬酸盐、磷酸盐和三羟甲基甲烷等缓冲剂都可能产生不需要的反应。硼酸盐：硼酸盐与许多化合物形成复盐、如蔗糖。柠檬酸盐：柠檬酸盐离子容易与钙结合，所以存在有钙离子的情况下不能使用。磷酸盐：在有些实验，它是酶的抑止剂或甚至是一个代谢物，重金属易以磷酸盐的形式从溶液中沉淀出来。而且它在 pH7.5 以上时缓冲能力很小。三羟甲基氨基甲烷：它可以和重金属一起作用，
3、但在有些系统中也起抑止的作用。其主要缺点时温度效应。这点往往被忽视，在室温 pH 是 7.8 的 Tris 一缓冲液，在 4时是 8.4，在 37时是 7.4，因此，4 配制的缓冲液拿到 37测量时，其氢离子浓度就增加了 10 倍。而且它在 pH7.5 以下，缓冲能力很差。缓冲液的 pH 值由哪些因素决定？设缓冲系统的弱酸的电离常数为 K（平衡常数），平衡时弱酸的浓度为酸 ，弱酸盐的浓度为盐，则由弱酸的电离平衡式可得下式：根据此式可得出下列几点结论：（1）缓冲液的 pH 值与该酸的电离平衡常数 K 及盐和酸的浓度有关。弱酸一定，但酸和盐的比例不同时，可以得到不同的 pH 值。当酸和盐浓度相等时
4、，溶液的 pH 值与 PK 值相同。（2）酸和盐浓度等比例也增减时，溶液的 pH 值不便。（3）酸和盐浓度相等时，缓冲液的缓冲效率为最高，比例相差越大，缓冲效率越低，一般地说缓冲液有效缓冲范围为 PK1pH。从上述可知，只要知道缓冲对的 PK 值，和要配制的缓冲液的 pH 值（及要求的缓冲液总浓度）时，可按公式计算出盐 和酸的量。这样算涉及到对数的换算，较麻烦，前人为减少后人的计算麻烦，经计算已为我们总结出 pH 值与缓冲液对离子用量的关系列出了表格。讲义附录部分节录有磷酸缓冲液的配制表。只要我们知道要配制的缓冲液的 pH，经查表便可计算处所用缓冲剂的比例和用量。例如配制 500nmpH5.8
5、 浓度为 0.1M 磷酸缓冲液。经查表知 pH5.8 浓度为 0.2M Na2HPO48.0 毫升，而 0.2M Na2HPO492.0 毫升。依此可推论出配制 100ml0.1M 的磷酸缓冲液需要 0.1M Na2HPO48.0 毫升，而 0.1M Na2HPO4需要 92.0毫升。所以 500ml 0.1M 磷酸缓冲液需要 Na2HPO4量为:需 Na2HPO4量为 :计算好后，按计算结果称好药品，放于烧杯中，加少量蒸馏水溶解，转移入 50ml 容量瓶，加蒸馏水至刻度，摇匀，便得所需的缓冲液。各种缓冲溶液的配制，均按下表按比例混合，某些试剂，必须标定配成准确的浓度才能进行，如醋酸、NaOH
6、 等。（1 ）醋酸盐缓冲溶液PHM/S醋酸钠(毫升数)M/S醋酸(毫升数)PHM/S醋酸钠(毫升数)M/S醋酸(毫升数)PHM/S醋酸钠(毫升数)M/S醋酸(毫升数)3.2 1 32 3.4 1 16 4.4 9.4 12.6 5.4 17.1 2.93.6 1.5 18.5 4.6 9.8 10.2 5.6 18.1 1.93.8 2.4 17.6 4.8 12.0 8.0 5.9 19 14.0 3.6 16.4 5.0 14.1 5.9 6.2 19.9 0.14.2 5.3 14.7 5.2 15.8 4.2 （2 ）磷酸盐缓冲液的配制1/15M 的 Na2HPO4 溶液（11.876
7、 克纯的 Na2HPO42H2O 溶于 1 升蒸馏水中）及 1/15M 的KH2PO4 溶液（将 9.078 克 KH2PO4 溶于 1 升水中）将着两种溶液依不同比例混合。PHNa2HPO4（ml）KH2PO4（ ml）PHNa2HPO4（ml）KH2PO4（ml）PHNa2HPO4（ml）KH2PO4（ ml）4.94 0.1 9.90 6.46 4.00 6.00 7.73 9.00 1.005.29 0.25 9.75 6.81 5.00 5.00 8.04 9.50 0.505.39 0.50 9.50 6.98 6.00 4.00 8.34 9.75 0.255.91 1.00 9
8、.00 7.17 7.00 3.00 8.69 9.90 0.106.24 2.00 8.00 7.38 8.00 2.00 9.18 10.00 0.006.47 3.00 7.00 (3)Tris 缓冲溶液贮备液溶液 A： 0.2M Tris（三羟甲基氨基甲烷）溶液 B：0.2M HCl50mlAXmlB ，用蒸馏水稀释到 200mlpH X（ml） pH X（ml）7.2 44.2 8.2 21.97.4 41.4 8.4 16.57.6 38.4 8.6 12.27.8 32.5 8.8 8.18.0 26.8 9.0 5.0（4 ）磷酸盐柠檬酸缓冲液的配制0.2M Na2HPO42H
9、2O 溶液及 0.1M 柠檬酸溶液，并依不同比例混合（见表）pHNa2HPO4（ml）柠檬酸（ml）pHNa2HPO4（ml）柠檬酸（ml）2.2 0.40 19.60 5.2 10.72 9.282.4 1.14 13.76 5.4 11.15 8.852.6 2.18 17.82 5.6 11.60 8.402.8 3.17 16.83 5.8 12.09 7.913.0 4.11 15.89 6.0 12.63 7.373.2 1.94 15.06 6.2 13.22 6.783.4 5.70 14.30 6.4 13.85 6.153.6 6.44 13.56 6.6 14.55 5.
10、453.8 7.10 12.90 6.8 15.45 4.554.0 7.71 12.29 7.0 16.47 3.534.2 8.28 11.78 7.2 17.39 2.614.4 8.82 11.18 7.4 18.17 1.834.6 9.35 10.85 7.6 18.73 1.274.8 9.86 10.14 7.8 19.15 0.855.0 0.30 9.70 8.0 19.45 0.55(5)盐缓冲液的配制a、M/20 硼砂（10.108 克 Na2B4O710H2O 溶在一升水中）b、M/5 硼酸M/20NaCl（12.45 克 H2BO2.925 克）NaCl 在一升水中
11、（见下表）pH a(ml) b(ml) pH a(ml) b(ml)7.0 0.45 9.55 8.2 3.5 6.57.2 0.75 9.25 8.4 4.45 5.557.3 1.10 8.9 8.6 5.5 4.57.8 2.05 7.95 9.0 8.2 1.88.0 2.70 7.3 (五)药品规格及其应用范围根据药品纯度不同一般可分为下列几类：（1）保证 试剂 （G、R）用在科学研究及微量分析方面（2）分析试剂 （A、R）定量分析时标定溶液用（3）化学纯试剂（C、P ）定性试验时用（4）实验试剂 （L、R）用于和实验结果关系不大的场合（5）工业品 用于大型或工业生产上在实验中用的最
12、多的是 C、P 一类，A、R 使用较少，G 、 R 非有特殊需要时，一般尽量用A、R 来代替，因为纯度高，价格很贵。除上述几种规格外尚有几种不以纯度分类的规格：（1）生物 试剂 （B 、R ）生物 体中提炼出来，成分含量相差较大，如培养微生物时用牛肉膏，酵母膏等药品即属此类。（2）指示剂（Ind）配制指示剂用（3）层析纯，色层分析时采用（4）生物染色剂 BS 如甲基兰（6）常用标准溶液的配制与标定(1)0.1mol/L NaOH 溶液1、配制方法：1）氢氧化钠中含有碳酸钠，所以不能直接配成纯溶液，因碳酸钠几乎不溶于饱和的氢氧化钠溶液中，故可以先配成饱和的氢氧化钠溶液（约 19mol/L）而将沉
13、淀弃去。另一个方法可加氯化钡 110 克溶于 100ml 水中配成饱和溶液，入瓶内密闭瓶塞，放置12 天，使碳酸钠沉淀，取上层清夜 6.3ml 加入刚煮沸过冷却的蒸馏水 750ml，可得浓度约为 0.1N 氢氧化钠溶液。2）称氢氧化钠结晶 5 克（或干燥棒状，或小片状得氢氧化钠 5 克）置于 4000ml 烧杯中，加水 300ml，使之溶解，加热并缓缓加入 1mol/L 氯化钡溶液 200ml。将碳酸钡沉淀后，将上层溶液倾入 1000ml 量筒中，加入刚煮沸冷却的蒸馏水，稀释至 1000ml 刻度处，放置使沉淀下沉，取其上清液。NaCO3BaCl 2BaCO 32NaCl2、标定取分析纯的苯二
14、酸氢钾（KHC8H4O4）置于称量瓶中，于烘箱内 105110下加热 2 小时，取出后放入干燥器内半小时，用倾出法在天平上称出约 0.45 克，称准至小数点第四位，共称两份，分别放入 150ml 三角瓶中，各加入 25ml 溶解后再加入 1酚酞指示剂 34 滴，然后配制好的氢氧化钠溶液装入滴管中，滴定上述两种样品，其误差不得超过 0.3，否则重行标定，氢氧化钠浓度计算如下式中：W 邻苯二酸氢钠称取邻苯二酸钾的重量（克）VNaOH滴定用去氢氧化钠毫升数0.20442邻苯二酸氢钾的毫克当量。（2）0.1mol/L 硫代硫酸钠溶液：1、配制方法：称取硫代硫酸钠（Na 2S2O35H2O）12.5 克
15、无水碳酸钠 0.2 克溶于煮沸后冷却的水中稀释到1000 毫升，其浓度约为 0.1mol/L，放置 34 天后才能进行标定。2、标定：取分析纯的碘酸钾置称量瓶中于烘箱中加热 105110两小时，移入干燥器内冷却，称出两份样品重量为 0.070.08 克（标准至小数四位）于 250ml 三角瓶中，各溶于 50ml 水中，待完全溶解后，各加入 30碘化钾溶液 10ml，12mol/L 硫酸 10ml，放置 3 分钟，稀释至150ml，用上述配制的硫代硫酸钠溶液滴定至草黄色，加入 1淀粉指示剂 5ml 继续滴定至兰色消失，记录硫代硫酸钠溶液的用量。另取 30碘化钾溶液 10ml，12mol/L 硫酸
16、 10ml，加水至 150ml 加入淀粉指示剂 5ml，用硫代硫酸钠滴定，作为空白试验：硫代硫酸钠溶液计算如下：WKIO3称取碘酸钾的重量（克）VNa2S2O3滴定用去硫酸钠溶液的毫升数VNa2S2O3空白实验用去硫代硫酸钠溶液的毫升数。214.2KIO3 的克分子量6KIO3 的当量注：硫代硫酸钠溶液易被空气氧化，如溶液中有硫细菌时，也能使硫代硫酸钠分解，而光线使硫细菌生长，此外硫代硫酸钠亦能与 CO2 作用，所以此溶液在放置过程中浓度逐渐降低，所以此溶液应放置在棕色瓶中密闭瓶塞。所以每隔一定时间应重新标定一次。如发现溶液浑浊（析出硫磺）就不能再用。（3）0.1mol/L 高锰酸钾溶液1、制
17、备方法：称取分析纯高锰酸钾 3.2 克入 1000ml 烧杯中，加 400ml 水加热溶解，然后稀释至一升，静置一周以上，用玻璃制成的虹吸管，吸取上层清液贮于棕色细口瓶中。如为了缩短时间亦可用制备的溶液在接近沸腾温度下加热一小时，然后旋转过夜，次日用布氏漏斗或沙芯漏斗过滤。2、标定：称取分析纯草酸钠入称量瓶中，于烘箱中加热 1501 小时，然后正确称出 0.250.30 克两份于 2 个 400ml 烧杯中各加水 100ml 及 12mol/L H2SO420ml，使之溶解，并加热至80，然后用高锰酸钾滴定，开始时滴定速度不宜过快，只能滴几滴，搅拌均匀待红色退去后，再以每分钟 2025 滴速度
18、进行滴定，直至溶液呈粉红色，数分钟不退为止，滴定后溶液温度不宜低于 60。（4）0.2mol/L 碘液1、制备方法：碘在水中溶解度很小，不可能达到 0.2mol/L，当溶液中有碘化钾存在时，碘和碘离子结合称为溶解度较大的才行。称取碘 6.5 克于 500ml 烧杯中加入 13 克碘化钾及水 15ml（水不可多加，否则碘不能溶解完全），不时搅拌待碘完全溶解后，加水稀释至 500ml，移入棕色瓶中，密闭塞紧置于阴暗处 3 4 天后再行标定。2、标定：准确称出在 105110烘二小时的分析纯亚砷酸（AS 2O2）0.200 克（小心，有剧毒）两份于 250ml 三角瓶中，各加入 6mol/L 氢氧化
19、钠 5ml 及水 10ml，溶解后，再加 6mol/L 盐酸，用水稀释至总体积为 100ml，再加入碳酸氢钠中和多余的酸，加 1淀粉指示剂5ml，然后用碘液滴定，其浓度计算如下：WAS2O2称取亚砷酸的重量（克）VI2滴定用去碘液毫升数0.04946亚砷酸的毫克当量稀释液定义：顾名思义就是我们所需的纯溶液加水（或其他溶剂）而降低浓度后得到的溶液，注意：是混合物！在日常的实际实验操作中，我们往往不需要纯溶液进行实验，因此采用加水稀释的方式来得到浓度较低的溶液，从而更好的实验。综上所述：凡是通过增加溶剂来降低浓度的方法所得到的溶液都是稀释液！2 稀释液的作用编辑1，阻止血液过快凝固血液暴露在空气中会凝固，当我们将血液滴入试纸采集区时，由于毛细效应，血液会向试纸的检测区扩散，但这需要一点时间，如果血液凝固过快，可能造成血液未扩散到检测区，就已经凝固，导致检测失败。另一方面，血浆中微凝血块过多，会减慢扩散的速度，检测结果产生的时间就会延长。2，稀释血液浓度加入稀释液后，血液的浓度会降低，HIV 抗体的浓度也随之降低，这就为试纸的灵敏度提出了更高的要求，需要试纸能够检测出低浓度的 HIV 抗体，也正因此，当检测结果为阳性时，那么结果是非常准确的。但是，如果加入的稀释液过多，HIV 抗体浓度太低，可能会导致试纸检测不出来，出现假阴性的情况。
