1、Native-PAGE 原理非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(Native-PAGE)是在不加入 SDS 疏基乙醇等变性剂的条件下， 对保持活性的蛋白质进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，常用于同工酶的鉴定和提纯。未加 SDS的天然聚丙烯酰胺凝胶电泳可以使生物大分子在电泳过程中保持其天然的形状和电荷，它们的分离是依据其电泳迁移率的不同和凝胶的分子筛作用，因而可以得到较高的分辨率，尤其是在电泳分离后仍能保持蛋白质和酶等生物大分子的生物活性，对于生物大分子的鉴定有重要意义，其方法是在凝胶上进行两份相同样品的电泳，电泳后将凝胶切成两半，一半用于活性染色，对某个特定的生物大分子进行鉴定，另一半用于所有样品的染色，以分析样
2、品中各种生物大分子的种类和含量。实验方法非变性聚丙烯酰胺凝胶和变性 sds-page 电泳在操作上基本上是相同的，只是非变性聚丙烯酰胺凝胶的配制和电泳缓冲液中不能含有变性剂如 SDS 等。一般蛋白进行非变性凝胶电泳要先分清是碱性还是酸性蛋白。分离碱性蛋白时候，要利用低 pH 凝胶系统，分离酸性蛋白时候，要利用高 pH 凝胶系统。酸性蛋白通常在非 变性凝胶电泳中采用的 pH 是 8.8 的缓冲系统，蛋白会带负电荷，蛋白会相阳极移动；而碱性蛋白通常电泳是在微酸性环境下进行，蛋白带正电荷，这时候需要将阴极和阳极倒置才可以电泳分离酸性蛋白。工作液配制1.40%胶贮液(Acr:Bis=29：1）；2.4
3、分离胶 Buf(1.5 M Tris-HCl，pH 8.8)：18.2 g Trisbase 溶于 ml 水，用浓 HCl 调 pH 8.8，加水定容到 100ml，4贮存；3. 4堆积胶 Buf(0.5 M Tris-HCl，pH 6.8)：6g Trisbase 溶于 80ml 水，用浓 HCl 调 pH 6.8，加水定容到 100ml，4贮存；4.10电泳 Buf（pH8.8 Tris-Gly）:30.3 g Trisbase， 144g 甘氨酸，加水定容到 L，4贮存；5.2溴酚蓝上样 Buf:1.25ml pH6.8, 0.5M Tris-Cl，3.0ml 甘油，.2ml 0.5%
4、溴酚蓝，5.5ml dH2O； -20 贮存；6. 10APS；7. 0.25考马斯亮蓝染色液:Coomassie blue R-250 2.5g，甲醇 ml，HAc 100ml, dH2O 450ml；8.考马斯亮蓝脱色液:100ml 甲醇，100 冰醋酸，800ml dH2O电泳胶的配制及电泳条件（上槽电极为负，下槽电极为正）1. 碱性非变性胶 17%分离胶(10 ml) 4%堆积胶(5 ml)2. 40%胶贮液 (40%T,3.3%C） 4.25ml 0.5ml3. 4分离胶 Buf(1.5 M Tris-HCl，pH 8.8)2.5ml 4. 4堆积胶 Buf(0.5 M Tris-H
5、Cl，pH 6.8) 1.25ml5. 水 3.2ml 6. 10APS 35ul7. TEMED 15 ul8. 10电泳 Buf（pH8.8 Tris-Gly）:100ml 稀释到 L电泳条件:100V 恒压约 20min，指示剂进入浓缩胶；改换 160V 恒压，当指示剂移动到胶板底部时，停止电泳，整个过程约 80min。染色和脱色:取出胶板于 0.25考马斯亮蓝染色液中染色约 30min，倾出染色液，加入考马斯亮蓝脱色液，缓慢摇动，注意更换脱色液，直至胶板干净清晰背景。也可以用银染或者活性染色。分离碱性蛋白要用低 pH 凝胶系统，并使用以下缓冲液体系：1. 分离胶：0.06M KOH，0
6、.376M Ac，pH4.3（7.7% T， 2.67% C）；2. 堆积胶：0.06M KOH，0.063M Ac，pH6.8（3.125% T，25% C）；3. 电泳缓冲液：0.14M 2-丙氨酸，0.35M Ac，pH4.5将正负电极倒置，用甲基绿（0.002%）为示踪剂实验操作同分离酸性蛋白。回收 native-PAGE 结束以后，采用电泳的方法进行回收，方法如下： 电泳结束以后，切取部分染色，然后根据染色结果切取含有蛋白质的胶带装入处理过的透析袋中，加入适量的缓冲液，最后把透析袋放入普通的核酸电泳槽中，并在电泳槽中加入适量的缓冲液（和透析袋中的缓冲液相同），低温电泳 2-3 小时即
7、可。回收蛋白所用的缓冲液一般和电泳所用的缓冲液相同。SDS-PAGE 和 Native-PAGE 的比较非变性凝胶电泳，也称为天然凝胶电泳，与非变性凝胶电泳最大的区别就在于蛋白在电泳过程中和电泳后都不会变性。最主要的有以下几点：1. 凝胶的配置中非变性凝胶不能加入 SDS，而变性凝胶的有 SDS。2. 电泳载样缓冲液中非变性凝胶的不仅没有 SDS，也没有巯基乙醇。3. 在非变性凝胶中蛋白质的分离取决于它所带的电荷以及分子大小，不像 SDS-PAGE 电泳中蛋白质分离只与其分子量有关。4. 非变性凝胶电泳中，酸性蛋白和碱性蛋白的分离是完全不同的，不像 SDS-PAGE 中所有蛋白都朝正极泳动。非
8、变性凝胶电泳中碱性蛋白通常是在微酸性环境下进行，蛋白带正电荷，需要将阴极和阳极倒置才可以电泳。5. 因为是非变性凝胶电泳，所有的电泳时候电流不能太大，以免电泳时产生的热量太多导致蛋白变性，而且步骤都要在 0-4 度的条件下进行，这样才可以保持蛋白质的活性，也可以降低蛋白质的水解作用。这点跟变性电泳也不一样。所以与 SDS-PAGE 电泳相比，非变性凝胶大大降低了蛋白质变性发生的机率问题和解答1. 非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳时预电泳是怎么回事的？预电泳时要加 6DNA 上样缓冲液吗？电泳 12 小时再加结合反应产物吗？预电泳是除去凝胶中没有聚合的单体和双体和聚合引发剂，提高分辨率，不加任何物质，一
9、般分钟后加样电泳。2. 银染的步骤是什么？银染的关键因素是什么？步骤是：（1） 固定：10% 冰乙酸 min。（2） 清洗：双蒸水冲洗凝胶次，每次 1min。（3） 染色：染色液（1g 硝酸银，.5mL37%甲醛，1L 双蒸水。现配）染色 30min。（4） 清洗：迅速洗凝胶次。（5） 显影：30g 碳酸钠，1.5mL37%甲醛，200uL 10mg/L 硫代硫酸钠。显影至清晰带纹出现。成功银染的关键因素包括：（6） 用超纯水（比如，NANOpure 或 Milli-Q 纯化）或者是双蒸水作银染。（7） 用提供的碳酸钠或者 ACS 试剂级的碳酸钠。（8） 在染色后，水清洗所用时间的长短很重要，
10、用不超过 5-10 秒的时间清洗胶，然后放入显色溶液中，一般在水里浸一下就好。（9） 甲醛和硫代硫酸钠（ul/1ml）在使用前，及时加入到显色液中。（10） 在使用前及时配染色液。3. 变性 PAGE 的上样缓冲液配方？如何准备上样的蛋白？是将细胞用超声破碎, 还是用细胞裂解液,大多细胞裂解液中均含有 SDS,不知有没有用于非变性PAGE 的裂解液.具有操作步骤是什么?非变性的 PAGE buffer 就是 0.5xTBE,上样缓冲液可以用普通的 loading buffer，含有 Tris,溴芬兰以及甘油即可，甘油是主要的沉淀作用成分。都可以自己配。细胞超声即可，超声后离心取上清.也有配 N
11、ATIVE-PAGE gel 所用 buffer 为 1*TBE,用的 running buffer 也是 1*TBE。还有一点就是要在配 gel 时考虑能使蛋白多聚体稳定的因素。4. 做了 naive-PAGE 没有条带，蛋白质是纯品，分子量很大，怎么回事呢？因为分子量很大，8%的胶浓度较合适。加样时加个 marker，可以检测胶制备是否有问题。银染方法比较灵敏，如果蛋白是一种酶，且可使某种底物显色的话，可以用活性染色试试，更灵敏。Native-PAGE 注意几个问题1. 非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳的过程中，蛋白质的迁移率不仅和蛋白质的等电点有关，还和蛋白质的分子量以及分子形状有关，其中蛋白质的等电点是最重要的影响因子，要根据蛋白质的等电点来选择对应的电泳缓冲系统；2. 非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳的过程中，要注意电压过高引起发热而导致蛋白质变性，所以最好在电泳槽外面放置冰块以降低温度；3. 蛋白质的分子量较大，则电泳时间可以适当延长，以使目的蛋白质有足够的迁移率和其它的蛋白质分开，反之亦然; 4. 变性样品的离子强度不能太高（I0.1mM）。调整样品的 PH 在 4.0 左右，这对于能否做好非变性样品非常重要。上样 BUFFER 中没有 SDS 之外，加入样品后不能加热.
