1、PCR是在模板DNA、引物和四种脱氧核苷酸等存在的情况下，DNA聚合酶依赖的酶促合成反应，整个扩增过程分变性、退火、延伸三步。经过若干循环后使目的DNA得以迅速扩增。,原 理,PCR技术自1989年开始被应用于临床检验以来，以其快速、简便、灵敏等优点很快地成为临床实验诊断学的一个技术热点.目前，临床PCR检验已经广泛使用商品化、规范化的试剂盒, PCR试剂盒的质量对测定结果的影响是直接而 且是至关重要的 试剂盒的质量不但受到生产过程中质量控制 诸要素的影响，原材料的质量、方法学设计、包 装、运输和贮存等一系列的环节，都对试剂盒的 质量有决定性的影响, 如何选择质量好的且符合自己实验室要的试剂盒
2、？ 如何保证拿到手里的试剂盒具有好的质量?,PCR或RT-PCR试剂盒的组成 核酸提取试剂 核酸扩增或反转录核酸扩增试剂 产物检测试剂,影响PCR试剂盒质量的因素 标本处理（核酸提取）方法、用于核酸扩 增的原材料及方法学设计 运输和贮存中所存在的问题,核酸提取方法 经典方法：酚氯仿抽提法，提取效率高、纯度好，但过程繁琐，易增加标本间相互污染的机会 简便方法：煮沸裂解法、玻璃粉或硅吸附法等 核酸提取除了要求操作简便外，更重要的是提取的效率及纯度，因此煮沸裂解法已被核酸纯化方法替代。,核酸提取的效率及纯度的检测 使用已知阳性（包括病毒含量）的溶血和脂血血清标本，用试剂盒提供的标本处理方法提取核酸后
3、扩增检测，与无溶血和脂血的血清标本比较，观察测定结果的差异，从而判断提取方法的优劣。,核酸扩增所需的原材料 寡核苷酸引物 扩增缓冲液 dNTP Taq酶以及反转录酶等,寡核苷酸引物和探针 引物和探针纯度对试剂盒的质量的影响 纯度的高低可根据260/280吸光度比值来判断，如小于2.0，则需重新纯化 引物和探针的结合特异性 应减少假阳性或假阴性的出现,扩增缓冲液和dNTP 缓冲液包括：Tris-HCL(pH8.38.8)，KCl或NaCl ，酶保护剂如小牛血清蛋白、明胶、Tween20或DTT Mg2+ ，过高或过低镁离子浓度均不利于扩增 四种dNTP的终浓度应相等,Taq酶以及反转录酶 酶浓度
4、太高，则会出现非特异扩增；过低时，则靶序列产量很低 。 每100l反应液中含12.5U（比活性为20U/pmol）Taq DNA聚合酶为佳,产 物 检 测 杂交固相：通常为聚丙烯微孔板和硝酸纤维素膜，其质量高低直接影响产物的测定 标记物：最常用的是辣根过氧化物酶（HRP）,试剂盒的运输和贮存贮存：核酸扩增部分20，产物检测部分试剂则应贮存于28 有效期:在适当的贮存温度下，PCR试剂盒的一般为6个月,临床PCR试剂盒的分类 临床PCR试剂盒按其测定目的可分为定性和定量测定两大类 前者主要是用于未知病因患者的临床病因诊断 后者则是用于已知患者治疗的动态观察,目前国内用于定性测定的PCR试剂盒的测
5、定模式主要有PCRELISA和PCR膜上杂交（杂交流）和分子信标荧光检测等；用于定量测定的试剂盒的测定模式则主要有TaqMan和Amplisensor荧光定量以及PCRElisa定量等,临床PCR试剂盒的选用原则 参考实际生产厂家的信息广告 参考同行对有关试剂盒的使用效果 参考有关机构的综合评价,如何选择适用的试剂盒 根据使用目的的选择 根据所在实验室的技术特点选择 根据所在地区患者的承受能力选择,临床PCR试剂盒的质检 内外包装的检查（厂家名称、检测目的、批准文号、批号和有效期等)，内包装的检查主要是看试剂瓶是否漏液、真空包装是否破损、试剂是否齐全以及是否有使用说明书等 试剂盒测定性能的检验（采用“血清盘”进行 ）,血清盘是由一定数量的原血清阴阳性样本、以及3-5份系列稀释阳性样本所组成 原血清样本可用于判断PCR试剂盒对特定病原体核酸检出的特异性、灵敏度和符合率；系列稀释阳性样本用于判断试剂的测定下限,血 清 盘,质检时，用待检PCR试剂盒测定血清盘中的各份样本，以血清盘的结果为标准，计算被检PCR试剂盒的灵敏度、特异性和符合率。,试剂盒评价四格表,表中a为真阳性，b为假阳性，各项指标的计算公式如下：特异性（%）=d/b+d100%灵敏度（%）=a/a+c100符合率（%）=a+d/a+b+c+d100 理想情况下，试剂盒的特异性、灵敏度及符合率应为100%。,
