1、凝胶层析法,思考题（课前设疑）,3.膜分离技术的原理是什么？它同一般的透析方法相比有何特点？,1.层析分离技术包括哪些技术？分别叙述凝胶层析、离子交换层析、亲和层析、高压液相层析、疏水层析、聚焦层析的分离纯化原理。,2.一般在粗品制备阶段和精品纯化阶段分别应采用哪些层析分离技术？,4.凝胶层析的应用范围有那几方面？,5.凝胶层析有何优缺点？,6.常用凝胶分那几类？分别叙述它们各自的应用范围及特点。,7.在实验中应如何选择凝胶与预处理？,8.细粒凝胶柱流速慢，洗脱峰越窄，分辨率高，适用于什么产品多分离或分析？粗粒凝胶柱流速高，但洗脱峰平坦，分辨率低，适用于产品制备那个阶段的分离？,9.什么是“类
2、分离”和“分级分离 ”？,10.在凝胶层析中要想得到好的层析结果应注意那些问题和采取那些措施？,11.凝胶用过后，有那几种保存方法？,12.葡聚糖凝胶离子交换剂，葡聚糖凝胶和离子交换剂有何异同及特点？,凝胶层析（gel chromatography）常出现多种名称 ：,如凝胶过滤、分子筛层析、排阻层析、凝胶渗透层析等。,凝胶层析的定义：,凝胶是一种具有多孔、网状结构的分子筛。利用这种凝胶分子筛对大小、形状不同的分子进行层析分离，称凝胶层析 。,凝胶层析的应用范围：,凝胶层析法适用于分离和提纯蛋白质、酶、多肽、激素、多糖、核酸类等物质。分子大小彼此相差25%的样品，只要通过单一凝胶床就可以完全将
3、它们分开。利用凝胶的分子筛特性，可对这些物质的溶液进行脱盐、浓缩、去热源和脱色。,凝胶层析的优点,凝胶层析具有设备简单、操作方便、分离迅速及不影响分子生物学活性等优点。目前已被广泛应用于各种生化产品的分离和纯化。,、凝胶层析的基本原理,凝胶层析的原理 l 分子大小不同混合物上柱； 2 洗脱开始，小分子扩散进人凝胶颗粒内，大分子被排阻于颗粒之外；3 大小分子分开： 4大分子行程较短，已洗脱出层析柱，小分子尚在进行中,凝胶是一类多孔性高分子聚合物，每个颗粒犹如一个筛子。当样品溶液通过凝胶柱时，相对分子质量较大的物质由于直径大于凝胶网孔而只能沿着凝胶颗粒间的孔隙，随着溶剂流动，因此流程较短，向前移动
4、速度快而首先流出层析柱；反之，相对分子质量较小的物质由于直径小于凝胶网孔，可自由地进出凝胶颗粒的网孔，在向下移动过程中，它们从凝胶内扩散到胶粒孔隙后再进入另,一凝胶颗粒，如此不断地进入与逸出，使流量增长，移动速率慢而最后流出层析柱。而中等大小的分子，它们也能在凝胶颗粒内外分布，部分进入颗粒，从而在大分子物质与小分子物质之间被洗脱。这样，经过层析柱，使混合物中的各物质按其分子大小不同而被分离。,Vt=Vo+Vi+Vg,Vt=R2h,V。简称为外水体积，Vo等于被完全排阻的大分子的洗脱体积。可以用一个已知相对分子质量远超过凝胶排阻极限的有色分子，如常用的蓝色葡聚糖-2000溶液通过柱床，即可测出柱
5、床的外水体积Vo。,Vi简称内水体积，可由gWr求得（g为干凝胶质量，单位为g，Wr为凝胶吸水量，以mLg表示）。Vi也可以从洗脱一种完全不受凝胶微孔排阻的小分子溶质（如重铬酸钾）的洗脱体积Ve计算，即,VeVoVi,对某物质在凝胶柱内洗脱体积Ve、Vo和Vi之间的关系可用下式表示：,VeVoKd.Vi,式中Ve为脱体积，它包括自加入样品时算起，到组分最大浓度出现时所流出的体积。Kd为每个溶质分子在流动相和固定相之间的一个特定的分配系数，它只与被分离物质分子大小和凝胶颗粒内孔隙大小分布有关。Kd可通过实验由Ve、Vo和Vi求得。,VeVoKd.Vi,可改写为：,（Ve-Vo） Kd= Vi,当
6、Kd0时，Ve=Vo，说明这种溶质相对分子质量大，完全不能进入凝胶颗粒微孔内，被排阻于凝胶颗粒之外而最先洗脱下来；,但实际上，约有1/5的内水因溶剂化作用而呈水合状态，妨碍小分子的自由扩散。故实际上Ve小分子 Vo0.8Vi；当0Kdl时，意味着溶质分子只有部分向凝胶颗粒内扩散，Kd愈大，进入凝胶颗粒内的程度愈大；Kd0.5时，其洗脱体积VeVo十0.5Vi。,当Kd1时，即Ve小分子 VoKdVi，说明这种溶质的相对分子质量小，完全向凝胶颗粒内扩散，在洗脱过程中将最后流出柱外。,不同型号葡聚糖凝胶柱床参数,二、凝胶层析的特点,1凝胶层析操作简便，所需设备简单。有时只要有一根层析柱便可进行工作
7、。分离介质凝胶完全不需要像离子交换剂那样复杂的再生过程便可重复使用。,2分离效果较好，重复性高。最突出的是样品回收率高，接近100。,4应用广泛。适用于各种生化物质，如肽类、激素、蛋白质、多糖、核酸的分离纯化、脱盐、浓缩以及分析测定等。分离的分子量范围也很宽，如Sephadex G类为102105d；Sepharose类为105108d。,3分离条件缓和。凝胶骨架亲水，分离过程又不涉及化学键的变化，所以对分离物的活性没有不良影响。,5分辨率不高，分离操作较慢。由于凝胶层析是以物质分子量的不同作为分离依据的，分子量的差异仅表现在流速的差异上，所以分离时流速必须严格把握。因而分离操作一般较慢。而且
8、对于分子量相差不多的物质难以达到很好的分离。此外，凝胶层析要求样品粘度不宜太高。凝胶颗粒有时还有非特异吸附现象 。,三、常用凝胶的结构和性质,凝胶层析法常用的凝胶有天然凝胶（如琼脂粉凝胶）和人工合成凝胶（如葡聚糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶）。,1葡聚糖凝胶,葡聚糖凝胶（Sephadex）具有良好的化学稳定性，是目前生化产品制备中最常用的凝胶。,G类葡聚糖凝胶（Sephadex-G）的最基本骨架是葡聚糖，它是一种以右旋葡萄糖为残基的多糖，分子间主要是-1,6-糖苷键（约占95%），分枝为l，3-糖苷键（约占5%），以1-氯-2，3-环氧丙烷（见右式）ClCH2CHCH2为交联剂将 O链壮结构连接为三维
9、空间的网状结构的高分子化合物（下图）,交联葡聚糖凝胶的化学结构,葡聚糖凝胶网孔大小可通过调节交联剂和葡聚糖的配比及反应条件来控制。交联度越大，网孔越小，吸水膨胀就越小。交联度越小，网孔越大，吸水膨胀就越大 。,G类葡聚糖凝胶常用G-X代表，X数字既代表交联度，也代表特水量。X数字越小，交联度越大，网孔越小，适用于分离低分子质量生化产品。X数字越大，交联度越小，网孔越大，适用于分离高分子生化产品。X数字也代表凝胶的持水量，如G-25表示1g干胶持水2.5mL，G-100表示 1g干胶持水10mL，依次类推。,2亲脂性葡聚糖凝胶,这种凝胶既亲脂又亲水，可在多种有机溶剂中膨胀。这种凝胶在pH2的不含
10、氧化剂的溶液中稳定。用低级醇为溶剂时，对芳香族、杂环族化合物仍有吸附作用。但用氯仿时则可去除对上述化合物的吸附作用，而对含羟基与羧基的化合物却有吸附作用 。,国产Sephadex LH20可用于分子筛层析、吸附层析和分配层析。很适用于脂肪酸、甘油脂、类固醇、维生素、激素类生化产品的分离。洗脱剂可用单一有机溶剂如甲醇、氯仿等，也可用混合溶剂如氯仿与甲醇的混合液。,3葡聚糖凝胶离子交换剂,在G类凝胶上引入一些酸性或碱性基团后，则制得各种葡聚糖凝胶离子交换剂 。,如引入磺乙基（SE-Sephadex）、羧甲基（CM-Sephadex）及二乙胺基乙基（DEAE-Sephadex A）等。葡聚糖凝胶离子
11、交换剂具有离子交换和分子筛双重作用。其结构多孔、疏松、非特异性吸附很少，层析时流速易控制，特别适用于蛋白质、酶、激素、多核苷酸等的分离纯化，以及生化制剂的除热原。,4聚丙烯酰胺凝胶,聚丙烯酰胺凝胶也是一种人工合成凝胶，其商品名为生物凝胶P（Bio-gel-P），和交联葡聚糖一样，为颗粒状干粉，在溶剂中能自动吸水溶胀成凝胶。其由单体丙烯酰胺,和交联剂甲叉双丙烯酰胺,通过自由基引发聚会形成聚丙烯酰胺凝胶。,（见下图）。只要控制单体用量和交联剂的比例，就能得到不同型号的凝胶。,聚丙烯酰胺凝胶的结构,在聚丙烯酰胺凝胶的合成过程中，单体和交联剂的配比可以任意改变。以（T）代表100mL凝胶溶液中含有的单
12、体和交联剂总克数，称为凝胶浓度。而其中交联剂占单体和交联剂总量的百分比称为交联度，以（C）表示，交联度越大，网孔越小，交联度越小，则网孔越大。聚丙烯酰胺凝胶全是由碳一碳骨架构成，稳定性较好，适合于做凝胶层析的载体。只有在极端pH条件下酰胺键才被水解为羧基，使凝胶带有一定的离子交换基团，故一般只在pH211的范围内使用。,像Sephadex一样，商品聚丙烯酰胺为颗粒状的干粉，它有十分明显形成块状并粘附在一起的倾向，在溶剂中能自动溶胀成胶。,根据聚丙烯酰胺凝胶的溶胀性质和分离范围的不同，可分成10种类型。各种类型均以英文字母P和阿拉伯数字表示，从Bio-Gel P-2至Bio-Ge1 P-300。
13、P后面的阿拉伯数字乘以1000即相当于排阻限度（按球蛋白或肽计算）。目前，美国Bio-Rad Laboratories生产并出售多种规格的Bio-Gel P。,5琼脂糖凝胶（Sepharose）,琼脂糖凝胶（agarose gel）可以分离葡聚糖凝胶和生物胶所不能分离的大分子，使凝胶层析的分离区间扩大到大分子和病毒颗粒，其最大范围可达相对分子质量108，但是由于琼脂有强烈的吸附作用，给使用造成了困难，后来，从琼脂中分离出两个组分，一个组分为带负电荷的琼脂果胶，含有磺酸基和羧基；另一组分叫琼脂糖，它不含有带电基团，其结构是有,-D-吡喃半乳糖和3，6脱水-L-吡喃半乳糖相结合的链状多糖。这种琼脂
14、糖被用来进行凝胶层析，它既具有琼脂凝胶相同的分离区间，又没有吸附作用。但其稳定性远不如葡聚糖凝胶和生物胶P，强酸强碱能引起结构破坏。最好使用条件控制在pH 49之间，温度040，超出此范围,可能被破坏。,琼脂糖凝胶是由琼脂中分离出来的天然凝胶。它的商品名因生产厂家不同而异。,瑞典的商品名称为Sepharose，有3种型号，即Sepharose 2B，4B和6B（同中国相同）。阿拉伯数字表示凝胶中干胶的百分含量。,美国的为BioGA，有6个型号，即Bio-G 0.5M，1.5M，5M，15M，50M和150M。阿拉伯数字乘以106表示排阻限度。,。,英国的称为Sagavac，又分为Sagavac
15、 2F，4F，6F，8F，10F和2C，4C，6C，8C，10C。前面的阿拉伯数字表示凝胶中干胶的百分数，F代表粉末状，C代表颗粒状。,丹麦的称为Gelarose，有5种类型，即2，4，6%，8和10。,琼脂糖凝胶做成珠状后不再脱水干燥，否则不能再溶胀恢复原有形状，因此商品大都以含水状态供应，并应在湿态保存。一般悬浮在l0-3 mo1/L EDTA和0.02%叠氮化钠溶液中。百分数表示干胶量。,四、凝胶层析技术,（一）凝胶的选择与处理,选择适宜的凝胶是取得良好分离效果的最根本的保证。选取何种凝胶及其型号、粒度，一方面要考虑凝胶的性质，包括凝胶的分离范围（渗入限与排阻限）还有它的理化稳定性、强度
16、、非特异吸附性质等；另一方面还要注意到分离目的和样品的性质。,凝胶粒度的大小对分离效果有直接的影响。般来说，细粒凝胶柱流速低，但洗脱峰窄，分辨率高，多用于精制分离或分析等。粗粒凝胶柱流速高，但洗脱峰平坦，分辨率低，多用于粗制分离，脱盐等。下图表示在同一流速下不同粒度的Sephadex G-25柱的洗脱效果。,凝胶粒度与洗脱效果的关系图,对生物样品来说，经常遇到的是两种分离形式。一种是只将分子量极为悬殊的两类物质分开，如蛋白质与盐类，称作类分离或组分离。另一类则是要将分子量相差不很大的大分子物质加以分离，如分离血清球蛋白与白蛋白，这叫做分级分离。后者对实验条件和操作要求都比较高。下面以最常用的葡
17、聚糖凝胶类为例，分别加以讨论 。,1类分离,目的是分开样品中分子量悬殊的“较大分子组”和“较小分子组”两类物质，并不要求分离分子量相近的组分。,选择凝胶时，应使样品中大分子组的分子量大于其排阻限，而小分子组的分子量小于渗入限。也就是说大分子的分配系数Kd= 0，小分子的Kd1。这样能取得最好,的分离效果。例如从蛋白质溶液中除去无机盐。我们知道，蛋白质的分子量都大于5000D，而无机盐的分子量一般在几十到几百之间。所以常选用Sephadex G-25凝胶作为分离固定相，因为它的分离范围是10005000D。被分离的两组物质的分子量正好落在分离范围的两侧。大分子组为全排阻，而小分子组为全渗入，其K
18、d值的差可达最大值1。对于分子量小于5000D的肽类进行脱盐操作则常选用Sephadex G-15凝胶。,2分级分离,目的是分开分子量不很悬殊的大分子物质。选择凝胶型号时必须使各种物质的Kd值尽可能相差大一些。为此，首先决不能使它们的分子量都分布在凝胶分离范围的一侧，也就是Kd不要都接近于0或1，而要使组分的分子量尽可能分布在凝胶分离范围的两侧，或接近两侧的位置。如果样品中含有3个组分的话，最好一个接近全排阻，另一个接近全渗入，,第三个为部分渗入，且分子量大于渗入限的3倍，并小于排阻限的13。因为分子量如与渗入限比较靠近，该组分分子在凝胶颗粒中运动所受的约束很小，不易与低分子组分分开。如分子量
19、与排阻限比较靠近则不易与高分子组分分开。如用Sephadex G-200分离血清蛋白质的效果要比Sephadex G-150为好。但也有人选用G-150，那是因为G-200强度太低不便操作的缘故（见下图）。,不同分离范围的葡聚糖凝胶上，血清蛋白的层析图,凝胶颗粒大小一般分为粗、中、细和超细四类。颗粒越细，分离效果越好，因为它容易达到平衡，但流速慢。颗粒越粗，流速越快，会使区带扩散，使洗脱峰变平变宽。在一般柱层析中，使用干颗粒直径在70m左右较合适。对于在水中保存的凝胶如琼脂粉凝胶颗粒直径应在150m左右。凝胶颗粒大小要均匀，这样流速稳定，效果较好。,葡聚糖凝胶和生物胶多以干粉形式保存，使用前需
20、用水或洗脱缓冲液充分溶账。在室温下让其充分溶账胀达到平衡，通常需要较长时间。较快的做法是将干胶往水里加，边加边搅，以防凝胶结块，然后放到沸水浴中加热接近100，几个小时就可以使其溶胀，还可起到除去颗粒内部气泡和杀菌作用。,（二）装柱,一般选用细长的拄作凝胶过滤。进行脱盐时，柱高50cm比较合适；分级分离时，100cm就足够了。,一般是在柱内先装入约1/3高度的水或缓冲液，然后将溶胀好的凝胶在搅拌成稀浆的情况下慢慢倒入柱内，使其自然沉降。如此连续操作，可以得到一个均匀的柱床。柱装得不好往往造成洗脱区带加宽，甚至使一些本来可以分开的区带重叠。如装柱时的操作压力太大，会使凝胶床压得太实，从而降低流速
21、。,层析柱（a）自制简易层祈柱（1玻璃管；2.橡皮塞；3尼龙网）；（b）普通商品柱；（c）双底板层析柱（1.洗脱液进出口；2.多孔底板；3柱床；4恒温水进口；5恒温水出口；6可调节的塞子）,层析系统连接示意图 1密封橡皮塞；2恒压管，3，恒压瓶；4，层析流出液，5可调蜾旋夹；6.自动收集器； 7.核酸一蛋白质检测仪,BS100自动部分收集器安装圈1反全阀；2换管臂；3滴管；4，5换管臂固定螺丝；6.竖杆；7.竖杆囤定螓丝；8报警板；9.试管；10收集盘；11.时间选挥旋钮；12.时间选择固定螺钉；13自动开关；14、指示灯；15.电源开关；16换向开关（逆、顺）；17手动开关,新柱装好后，要用
22、洗脱缓冲液平衡，一般用35倍体积的缓冲液在恒压下流过柱床。,新装好的柱要检验其均匀性可用带色的高分子物质如蓝色葡聚糖-2000配成2mg/mL的溶液过柱，观察色带是否均匀下降。也可以对光检查，看其是否均匀或有无气泡存在。,（三）加样,由于凝胶层析的稀释作用，似乎样品浓度应尽可能大才好，但样品浓度过大往往导致粘度增大，而使层析分辨率下降（下图）。一般要求样品粘度小于0.01Pas（帕斯卡秒），这样才不致于对分离造成明显影响。对蛋白质类样品浓度以不大于4为宜。如果样品浑浊，应先过滤或离心除去颗粒后上柱。分析用量一般为每100mL床体积加样品12mL，制备用量一般为每100 mL床体积加样品2030
23、 mL，这样可使样品的洗脱体积小于样品各组分之间的分离体积，获得较满意的分离效果。,样品黏度对洗脱曲线的影响,（1）加葡萄糖2 000，使终浓度为5%，相对粘度11.8;（2）加葡萄糖2 000，使终浓度为2.5%，相对粘度4.2; （3）加葡萄糖2 000，使终浓度为1%.,样品与柱床体积比例悬殊时分离效果好，但过少的样品量不但会造成设备和器材的浪费，降低工作效率，还会造成样品稀释。,样品上柱是凝胶层析中最关键的一步。理想的样品色带应是狭窄且平直的巨型色谱带。为了做到这一点，应尽量减少加样时样品的稀释以及样品的非平流流经凝胶层析床体。反之将造成色谱带扩散、紊乱，严重影响分离效果。,加样时应尽
24、量减少样品的稀释，及凝胶床面的搅动。这一点在分级分离时尤为重要，应严格按一定的操作程序进行，通常有下列三种方法：,1直接将样品加到层析床表面,2利用两种液体比重不同而分层的原理，将高比重样品加入床表面低比重的洗脱液之中，样品就慢慢均匀地下沉于床表面，再打开出口，使样品渗入层析 。,3.可用微量泵控制,（四）洗脱,为了防止柱床体积的变化，造成流速降低及重复性下降。整个洗脱过程中始终保持一定的操作压，并不超限是很必要的。流速不宜过快且要稳定。冼脱液的成分也不应改变，以防凝胶颗粒的涨缩引起柱床体积变化或流速改变。在许多情况下可以用水作洗脱剂，但为了防止非特异吸附，避免一些蛋白质在纯水中难以溶解（析出
25、沉淀），以及蛋白质稳定性等问题的发生，常采用缓冲盐,溶液进行洗脱。离子浓度至少0.02mol/L方可获得较好的结果，因为凝胶含有少量羧基，会吸附少量阳离子而排斥少量阴离子。洗脱用盐等介质应比较容易除去才好，通常，氨水、醋酸、甲酸铵等易发挥的物质用得较多。对一些吸附较强的物质也可采用水和有机溶剂（如水-甲醇，水-丙酮等）的混合物进行洗脱。,洗脱剂的流速对分离效果也有很大影响，下图显示了同一凝胶柱在不同流速下的洗脱曲线。可见较快的流速下得到的冼脱峰也宽。流速低洗脱峰窄而高。也就是说，流速较低，分辨率较高，样品稀释较轻。,流速对洗脱曲线的影响,凝胶层析拄洗脱的三部分示意图,洗脱时的流速与操作压有关，
26、与凝胶的型号和粒度也有关，在同样的操作压下洗脱时往往编号小的葡聚糖凝胶，以及颗粒粗的凝胶流速大；编号大的，粒度细的流速慢。对于某种凝胶来说，在一定范围内，操作压加大，流速加快。对强度较大的凝胶，如Sephadex G-1050，在相当大的柱压范围内流速（）与操作压（F）成正比，与柱长（L）成反比：,= K PL,而对于强度差的凝胶，符合以上公式压力范围很小。进一步加大压力时，由于凝胶颗粒变形流速反而降低常见的几种葡聚糖凝胶柱床承受压力与洗脱流速的关系见下图。,几种葡聚糖凝胶拄床承受压力图,各种层析柱装置的操作压（或静水压）（a），（b）操作压等于柱或贮液器内液面和出水接管末端的高度差；（c），
27、（d）压力的大小是由恒压瓶内空气入口管的底部至出口接管末端的高度计算。向下（c）或向上（d）移动出水管无关紧要,欲达到流速恒定的目的，可自制恒压加液装置（下图），更可靠的是使用微量恒流泵。,凝胶层析恒压加液装置,（五）凝胶的再生和保养,在洗脱过程中，所有组分一般都可被洗脱下来，所以装好柱后，可反复使用，无需特殊的再生处理。但多次使用后，凝胶颗粒可能逐渐沉积压紧，流速变慢。这时只需将凝胶自柱内倒出，重新填装。或使用反冲法，使凝胶松散冲起，然后自然沉降，形成新的柱床，这样流速会有所改善。,葡萄糖凝胶和琼脂糖凝胶都是碳水化合物，能被微生物（如细菌和霉菌）分解。聚丙烯酰胺凝胶本身不被微生物作用，但微生
28、物还是能在此凝胶液中和凝胶床上生长，这样会破坏凝胶的特性，影响分离效果。为防止细菌生长和发酵，可用0.02叠氮化钠、0.05%三氯叔丁醇（仅在弱酸有效，也适用于其他离子交换剂）或0.002洗必泰、0.01醋酸苯汞（在弱碱中有效，也适用于其他阴离子交换剂）以及0.1molL氢氧化钠溶液等作防腐剂。层析前再用水或平衡液将防腐剂洗去。,凝胶用过后，有几种保存方法：,湿态保存：在水相中加防腐剂，或水洗到中性，高压灭菌封存（或低温存放）；,半收缩保存：水洗后滤干，加70乙醇使胶收缩，再浸泡于70乙醇中保存；,干燥保存：水洗后滤干，依次用50、70、90、95乙醇脱水，再用乙醚洗去乙醇，干燥(或6080烘
29、干）后保存。加乙醇时，切忌一上来就用浓乙醇处理，以防结块。,紫外检测仪及记录仪,紫外检测仪是生物大分子液相色谱中常用的检测仪器，可用于连续测量液体流的紫外吸收，用与其相连接的记录仪记录下吸光值的变化情况，广泛应用于生物大分子的分离纯化。,一.北京新技术所生产的紫外检测仪及记录仪的使用：,1仪器的连接：紫外检测仪出厂时安装280nm滤光片，使用前应确认波长转换开关在280nm处。用信号线将紫外检测仪和记录仪连接，分别开启电源。层析柱出口的导管接到检测仪的进样口（下口），检测仪的出样口（上口）与样品收集装置连接。,2紫外检测仪的预热：将检测仪量程旋钮至T档位置，预热约1h。,3记录仪的调整：,（1
30、）检测仪的输出电压为100mV，所以记录仪的量程放在100mV；,（2）按下输入键，记录仪输入短路，用zero旋钮调节0mV，弹起zero键，与检测仪输出连接。注意在测定过程中保持记录仪和检测仪的连接状态，不能再调zero旋钮；,（3）调整纸速2cm/h，开始记录时放下记录笔，按下开始键。,4检测仪的调整：,(1) 当缓冲液流入吸收池后，将灵敏度旋钮拨到T，调节透过率旋钮，使输出信号在9095mV之间；,5实验完毕将记录笔抬起，按下记录仪纸速快键，使记录图谱走出，小心取下图谱，勿将记录纸错位，切记将纸速还原。,(2) 将灵敏度旋钮调节到所用的A档（使吸收峰的高度适中），调节吸光值旋钮，使输出在
31、5mV左右，即可进行吸光值测定。在测定过程中各调节旋钮不要再动，测定完毕将量程旋钮调回T档位置。,二.Amersham生产的紫外检测仪及记录仪的使用：,1仪器的连接和预热：同上,2记录仪的调整：,(1) 记录仪的量程放在10mV；,(2) 按下zero键，调节adjust旋钮使记录笔至记录纸的右端，注意实验记录时zero键必须处于弹起位置；,(3) 调整纸速0.5mm/min，开始记录时按下pen up-down键放下记录笔，按下rec. off-on键开始记录。,（2）将灵敏度旋钮拨到SHORT，用记录仪的调零旋钮调零；,（3）将灵敏度旋钮拨到2，用zero旋钮调整记录仪基线，将灵敏度旋钮拨
32、到合适的灵敏度范围，用zero旋钮微调记录仪基线,4实验完毕将记录笔抬起，按下feed键，使记录图谱走出，小心取下图谱，勿将记录纸错位。,（1）当缓冲液流入吸收池后，将AU/%T开关拨到AU,3检测仪的调整：,五.V。和Vi的测算,层析用凝胶柱在使用前一般都应了解其V。和Vi的大小。对分析用柱尤其是这样。稳定的凝胶拄床，V。通常占柱床总体积Vt的30左右。V。太大则说明柱床没有达到稳定。对于相同型号凝胶所装的凝胶柱来说，粗颗粒者的V。往往比细粒者为大。,1V。及Vi的测算,（1） 重量法,已知：,VtV0十Vi十Vg/4d2h,Vi=gWr,式中g为干胶重量，Wr为“得水率”，即每克干胶之吸液
33、量。,所以 ：,V。=Vt（Vi十Vg）,但这种算法不够准确，主要原因是Vg难以计算，它和凝胶的水化程度有关。一般粗略地将其估算为1cm3g干胶。,（2） 过柱法,已知物质的洗脱体积,VeVo十KdVi,如用全渗入（Kd1）或全排阻（Kd0）的物质过柱，测量其洗脱体积，便可计算出该凝胶柱的V。值及Vi值。实验室中最常用的是蓝色葡聚糖（Kd0）及重铬酸钾（Kd1），硫酸铵（Kdl）等。,2Kd及Kav的测算,当测得某物质的Ve,并不知道该凝胶柱的柱床总体积Vt，内水体积Vi及外水体积Vo时，根据以下公式不难算出分配系数Kd和Kav值。,Kd与Kav，甚至Ve被认为是一种组分（物质）对于某一个凝胶
34、柱的特征常数。在判断高组分的分离情况，测定分子量以及预测放大柱床后的洗脱体积方面是很有用的。,3分辨率,凝胶层析中，两物质（A和B）的分辨率（R）定义为：,式中WA、WB分别为两物质洗脱峰的体积。也就是说，分辨率与洗脱体积的差值成正比，而与两物质的洗脱峰宽度成反比（下图）。,洗脱分辨率图,当R值1，两物质完全分开。小于l时则不能完全分离。提高分辨率的方法只有增大Ve或减小两物质洗脱峰的体积。,因为 VeAVo十KdAVi,VeBVo十KdBVi,VeVi（KdBKdA） KdVi,由于Kd是常数，只有增大Vi才能使Ve增加。这就是为什么在进行组分分离时要求较大柱床体积的原因。,减少（WA+WB
35、）的方法有浓缩样品（但粘度不能太大）；选用小粒度凝胶、流速适当减慢等。,六.葡聚糖凝胶离子交换剂使用方法,新购进的阳离子交换剂（如CM-Sephadex C-25）为Na型，阴离子凝胶交换剂（如DEAE-Sephadex A-25）为Cl-型，使用前要按一般离子交换剂的使用方法进行转型处理。1g阴离子交换剂约用100mL,0.5mo1/L NaoH溶液浸泡20min后减压过滤，充分洗涤，再用等量0.5molL HCL处理，洗至中和备用。阳离子交换剂lg约用100mL 0.5molL HCL浸泡20min后过滤，充分洗涤，再用等量0.5mo1L NaOH溶液处理20min，洗至中性备用。,将以上
36、处理好的葡聚糖凝胶离子交换剂，用2030倍量与层析时所用的同种缓冲液浸泡（但浓度要高，如0.10.5molL），再用同种酸或碱调节至所需要pH值，放置1h后，待pH值不变即可减压过滤。,凝胶离子交换剂保存时，需先转成盐型。其他使用方法均同G-类葡聚糖凝胶。再次用缓冲溶液充分浸泡、洗涤，除去气泡后即可上柱。,七、葡聚糖凝胶在生化物质制备中的应用,（）用G类葡聚糖凝胶浓缩高分子生化物质。,（二）用G25脱盐,（三）测定分子量,激肽放酶释G-25拄脱盐,分子量的测定方法有两种,（1）求解法 为了求得上述方程中的两个常数K和C,先以两个已知分子量的蛋白质过柱。设其分子量分别为M1、M2，洗脱体积分别为
37、Vl、V2，,解方程组：,Ve1=C-KLogM1,Ve2=C- KLogM2,求得C和K以后，将任何一个待测物质的Ve值代入方程便可计算得出其分子量 。,（2）标准曲线法 对于特定的测定系统，先以3个以上（最好更多些）的已知分子的标准蛋白（目前已有配套标准蛋白系列产品出售）过柱，测取各自的Ve值。以Ve作纵坐标，LogM作横坐标制做标准曲线。在同一测定系统中测出未知物质的Ve值便可由标标准曲线求得分子量。分子量在10 000150 000之间的球形蛋白用此法测出的分子量误差在10左右。对于线性分子的误差还可大于此值。,如果以VeVo对分子量对数作图，同样也可以得到一个线性关系的标准曲线。Ve
38、Vo与柱子大小无关，也不受吸附效应的影响，因此,（四）分离多组分混合物,用葡聚糖凝胶分离多组分混合物除利用分子筛效应外，还可以利用某些物质与凝胶具有程度不等的弱吸附作用。如用G25分离催产素和加压素结合物。用G25分离氨基酸混合物等。由于酸性氨基酸受到胶粒部分排斥而先被洗出，而芳香族氨基酸有弱吸附作用故较后排出，碱性氨基酸吸附最强，所以最后排出。,测定效果较好。蛋白质、酶、激素、多肽、多核苷酸、多糖类高分子量生化产品都可以用凝胶过滤法测定分子量。,G-50分离粗制胰岛素图,层析后圆盘电泳图,经葡聚糖凝胶分离粗制胰岛素可分出a，b，c三个成分，再经圆盘电泳分析，发现a峰为高分子杂质， b峰主要为
39、胰岛素原和类似物， c峰为胰岛素和类似物,G25分离氨基酸混合物图,八.数据处理,一.曲线的制作,将1mL标准蛋白混合液上拄，然后用0.025mol/L氯化钾0.2mol/L乙酸溶液洗脱。调节流速3.0mL/10min，用自动收集器分管收集（3mL/管），核酸蛋白质检测仪280nm处检测，记录洗脱曲线。确定每个标准蛋白的最大峰值。,凝胶层析拄洗脱的三部分示意图,同时根据已测出的Vo和Vi以及通过量柱的直径和凝胶拄床高度计算出的Vt方便求出Kd和Kav。,VeV0 Kd= Vi,VeV0 Kav = VtV0,实验要求；,作标准曲线,1.Ve1gMr,2Kd1gMr,3Kav1gMr,4Ve/V
40、o 1gMr,二、测定未知蛋白分子量,按未知蛋白的洗脱体积，在标准曲线上(下图）查出相应的1gMr值，以次确定未知蛋白分子量,洗脱体积与相对分子质量的关系,1.大豆蛋白酶抑制剂；2.细丙二聚体；胰蛋白酶原；4.卵清蛋白；5.血清蛋白；6.血清蛋白二聚体；7.IgG；8.甲状腺球蛋白；9。蔗糖；10.糖原；11.细丙551；12.细丙；13.Rnase;14. -乳清蛋白；15.肌红蛋白 上方曲线为G-75；下方曲线为G-100,九.凝胶过滤层析经常遇见的问题,1流速慢,（1）有气泡、出水管阻塞,（2）没打开夹子,（3）柱压太紧（操作压过大、长期使用、接头漏气）,2拄内产生气泡,（1）上水口不流或皮管破裂，洗脱液外流,（2）接口漏气，如上水口螺丝拧的不紧,3条带扭曲,（1）胶面不平,（2）样品或洗脱液中有颗粒,（3）装拄不均匀,4分辩率不高,（1）装拄不均匀,（2）样品量过大,（3）流速太快,（4）拄不垂直或拄不合适,（7）胶不适当,（5）长菌,（6）拄下口软管太长,
