1、Procedures for AFLP,AFLP反应程序主要包括模板DNA制备，酶切片段扩增及凝胶电泳分析这3个基本步骤。各步骤具体的过程有：首先要制备高分子量(HMW)基因组DNA，选择6个碱基识别位点的限制性内切酶(通常是EcoRI或PstI或SacI)。酶切后的限制性片段在T4连接酶的作用下与特定的接头相连接，形成带有接头的特异性片段。1.DNA片段的预扩增。2.在Taq聚合酶的作用下，完成AFLP的选择性扩增。3.PCR产物变性后在含尿素的聚丙烯酰胺变性胶上电泳。4.多态性比较分析，特异片段回收克隆分析,AFLP,Characterization of AFLP,理论上，可以采用的限制
2、性内切酶及选择碱基的种类、数目很多，所以标记数目是无限的。每次谱带在50-100条之间，多态性检测非常有用呈典型的孟德尔方式遗传可用于作为遗传图谱和物理图谱的位标。可用于分析基因组DNA、克隆的DNA大片段，对模板浓度不敏感，即使模板浓度存在差异，也会得到强度一致的谱带。,AFLP,Adaptor for AFLP,AFLP引物是一种人工合成的单链核苷酸，一般长度为18-20bp.由核心顺序（Core）、内切酶位点特异顺序（ENZ）和选择性核苷酸顺序（EXT）三部分组成。如下图：,AFLP,核心顺序（core） ENZ EXTEcoRI引物： 5-GACTGCGTACCAA TTC NNN-3
3、MseI 引物： 5-GATGAGTCCTGAG TAA NNN-3,Pre-amplification,酶切片段要经过连续2次PCR扩增，通过这样两步扩增反应使产生的扩增结果更清楚、重复性更好。第一次PCR扩增被称为预扩增反应，所用的AFLP引物只含有1个选择性核苷酸，选择扩增性能较差，因此大量的扩增产物在凝胶中往往形成连续一片。预扩增反应条件与常规PCR反应条件大致相同。预扩增反应的产物经过大量稀释后作为第2次扩增放映（选择性扩增）的模板,AFLP,Selective Amplification,选择性扩增的反应条件与普通PCR有所不同，主要不同之处是复性温度，它是采用温度梯度PCR, 其
4、PCR开始于高温复性（一般采用65 C）以期获得最佳选择性。以后复性温度逐步降低，一直降到复性效果最好的温度（一般是56C），然后保持这个温度下复性，完成其余的PCR循环周期。,AFLP,Procedures for AFLP,AFLP,Procedures for AFLP,AFLP,AFLP标记,不需要基因组的信息重复性较高DNA需量少高多态性、高效率、高精确性可标记整个基因组,AFLP,优点：,缺点：,被认为是显性标记,什么是Single Nucleotide Polymorphisms (SNPs)?,ATGGTAAGCCTGAGCTGACTTAGCGT-AT ATGGTAAACCTG
5、AGTTGACTTAGCGTCAT SNP SNP indelSNPs result from replication errors and DNA damageThey are a polymorphic bit state at a nucleoside address,Haplotypes SNP Barcodes,ATGGTAAGCCTGAGCTGACTTAGCGT-ATATGGTAAACCTGAGTTGACTTAGCGTCAT,Types of Molecular Markers,RFLP - restriction fragment length polymorphism (pm)
6、（限制性片段长度多态性）VNTR - variable number tandem repeat（变化数目的串联重复）RAPD - random amplification of polymorphic DNA（随机扩增的多态性DNA）AFLP - amplified fragment length pm（扩增片段长度多态性）SSR - simple sequence repeat（简单序列重复）,12,Application of Molecular Markers,Applications,1.种质评价和核心种质筛选 鉴别品种和品系；检测资源多态性； 鉴定新种质；核心种质筛选2.分子标记早
7、期辅助选择 育种亲本选择；育种过程监测；早期分子辅助选择 （marker assisted selection, MAS）3.构建遗传连锁图 基因定位（QTL);比较基因组研究;基因克隆（图位克隆）4. 生物起源和进化研究,品种鉴别与产权保护,定义：能够鉴定作物品种之间差异的电泳图谱。特点：高度的个体特异性、环境的稳定性及丰富的多态性。用途：鉴定品种真实性和纯度，用于新品种登记和品种知识产权保护等。其中AFLP被推荐为指纹图谱绘制的最佳方法之一。,品种的DNA指纹图谱,引自庞晓明博士论文（2002）,分子标记辅助选择（MAS,marker assisted selection),分子标记辅助选
8、择几乎不受环境条件的影响，还可以跟踪外源基因，克服回交的缺点，可大大提高选择的效率。长期以来，选择都是基于植株的表型性状进行的。植物的许多性状为数量性状，受许多微效基因的控制，且易受环境的影响。DNA标记的出现使植物育种从表型选择过渡到分子育种的新阶段。,快速有效地选择出带有目标基因的单株,表现在:1.不受环境条件及生长发育阶段的影响，在苗期或低世代就可进行筛选;2.利用共显性标记可直接对隐性目标基因进行选择，无需测交或自交检验;3.如果目标性状不能在当代进行选择，采用MAS可直接在当代确定。,这是2005年发表在PNAS上关于蔷薇科果树分子标记辅助育种的文章，共列出了29个外形或是农艺性状的
9、基因或标记。,2002年，在李上Bergougnoux 等报道了抗线虫的多个分子标记，包括3个RAPD标记，1个AFLP标记，3个SSR标记。其中的一个RAPD和AFLP标记成功地转化为SCAR标记。并在桃和杏的多种组合中验证了该标记作为分子辅助筛选的可靠性。,Genomic Resources to Improve Fruit Size and Quality Traits in Cherry,Amy Iezzoni, Wayne Loescher,Dechun Wang, & Esther van der Knaap,快速选出特定遗传背景的单株,在育种中不仅要考虑优良性状的导入，还必须考虑
10、保持其整个基因组的遗传背景基本不变。通过MAS技术，借助于饱和的分子标记连锁图，对各选择单株进行整个基因组的组成分析，进而可以选出带有多个目标性状而且遗传背景良好的理想个体。,基因聚合,将多个有利基因通过选育途径聚合到一个品种之中,这些基因可以控制相同的性状也可以控制不同的性状。基因聚合突破了回交育种改良个别性状的局限,使品种在多个性状上同时得到改良。,园艺作物的报道,关于基因聚合和或是组合多个QTL的策略在水稻上，特别是水稻抗病育种得到广泛的应用。在园艺作物的蔬菜也有应用。左边的报告就是关于番茄果实QTLs的。,在果树上也有应用前景，右边的报告作者是2003年提出了在果树上应用基因聚合或是组
11、合多个QTL.,利用遗传图和遗传标记可用来加速植物育种进程。经典遗传图谱：形态、生理和生化标记，数量极为有限，图谱分辨率大都很低，表现标记少，图距大，饱和度低。分子标记技术的发展，使图谱上标记的密度越来越高。以具有遗传多型性的分子标记为“路标”。,植物基因组遗传作图,www.mainlab.clemson.edu/gdr,目前，果树作物的做图发展迅速：在甜橙已发表的遗传图中，已有200多个标记。蔷薇科果树还专门建立了做图网站：www.mainlab.clemson.edu/gdr. 里面已搜集了苹果、梨、桃、杏、李、樱桃、树莓等果树的多个杂交组合的图谱。,2008年7月发表在 Plant Ph
12、ysiol上的蔷薇科果树遗传标记和遗传图,产量、品质、熟期等大多数重要农艺性状，均表现数量性状的遗传特点，受许多数量基因座位（Quantitative Trait Loci, QTLs）和环境因子的共同作用。数量遗传学无法确定控制数量性状的QTLs数目，也无法确定单个QTL的遗传效应及染色体位置。分子连锁图谱的发展，可以实现对单个QTL遗传效应的追踪，从而应用于分子标记辅助选择。目前已发展了QTLs定位的多种方法。,数量性状基因的定位,QTL作图所需的数据,遗传标记数据,数量性状数据,基于图谱的基因克隆,图位克隆,条件：(1)目标基因附近紧密连锁的DNA标记；(2)知道这些标记与目的基因的位置
13、一旦建立与目的基因紧密连锁的分子标记图，就可以找到染色体步行的起始点，从而进行定位克隆。通过图位克隆得到的基因大都来源于模式植物，必须拥有高密度的分子图谱。对于果树作物来说，这条途径几乎不可行。,比较基因组研究,利用相同的DNA分子标记（主要是cDNA标记和基因克隆）在相关物种之间进行遗传或物理作图，比较这些标记在不同物种基因组中的分布特点，揭示染色体或染色体片段上的基因及其排列顺序的相同或相似性，并由此对相关物种的基因组结构和起源进化进行分析。这种标记也叫可转移标记（portable /transferable marker.),新发现：不同物种之间在标记探针的同源性、拷贝数及连锁顺序上都具
14、有很大程度的保守性。番茄、马铃薯和辣椒（Tanksley等1988；1992）；蔷薇科苹果属和梨属之间的共现性（Dirlewanger 等，2004）,启示：模式植物上遗传作图成果可推而广之。可借助比较基因组共享分子标记，使建立高密度遗传连锁图可资利用的标记显著增加，从而大大提高了获取离目标基因很近分子标记的的可能性。,蔷薇属遗传图与抗白粉病性状的QTL定位（左一），中间和右边的连锁图分别是是李属（Lalli等，2005）和苹果属（Calenge等，2005）的连锁图与抗白粉病QTL定位。,植物遗传多样性、起源、分类和进化研究,对植物种质资源遗传多样性的全面了解，对于拓宽遗传基础的育种策略十分
15、重要。植物的遗传多样性是品种遗传改良的基础。,芸香科起源、分类和进化研究,引自李映志博士论文（2007）,甜橙起源分析,33,柚子来源 ： 橘子来源 1 : 3,C. grandisPummelo,C. sinensisSweet orange,C. reticulataMandarin,C. reticulataMandarin,Somatic mutations,Inter-specific hybrid,Todays sweet orange cultivars,引自Nature Genetics 45:59-66,苹果进化故事,34,研究 鉴定了15个在苹果中特异表达的MADS-box因子，为梨果性状的形成机理提供了重要的信息Nat Genet 2010, 48: 833-839,苹果所在的梨族发生了近期的全基因组复制（5000万年），染色体数目由原来祖先种的9条自动加倍到17条,葡萄进化故事,35,9 K SNP标记， 1000个样品Proc Natl Acad Sci USA. 2011;108:3530,22个SSR, 384个SNP标记， 2273个样品BMC Plant Biology, 2013, 13: 39,
