1、73第四章 生物样品的采集、储存及预处理第一节 生物样品的采集、储存体内药物分析的任务和分析对象具有如下特点:被测定的药物和代谢物的浓度极低；样品介质复杂，其中存在各种各样直接或间接影响测定结果的物质，大多需要分离和净化；仅有少量样品可供分析，尤其是在连续测定过程中，很难再度获得完全相同的样品；样品的稳定性需要特别注意等。一、生物样品的采集生物介质(biological matrix)包括全血、血浆、血清、尿、粪、唾液和各种组织。其中最常用的生物样品是血液和尿液。1.血样的采集供测定的血样应能代表整个血药浓度。若能从动脉或心脏取血最为理想，但只能用于动物，不能用于人。动物采血可根据不同种类及实
2、验需要，采取适当的方法。如大、小鼠可由尾动脉、静脉、心脏、眼眶取血或断头取血等，家兔可由耳缘静脉、颈静脉等多处取血，犬可由前、后肢静脉等处取血。对于受试者通常采用静脉取血(成人从肘正中静脉取血，小儿从颈外静脉取血)。静脉取血一般将注射器针头插入静脉血管抽取。抽取的血液转移至试管或其它容器时应缓缓压出，以防血细胞破裂。全血在加肝素或柠檬酸、草酸盐等抗凝剂后，离心分取血浆，其体积约为全血的一半。血清则是由血液中纤维蛋白原等影响下，引起血块凝结而析出，离心取用，而血块凝结时往往易造成药物吸附的损失。全血直接作为样品时，也应加入抗凝剂混匀，防止凝血。对大多数药物来说，血浆浓度与红细胞中的浓度呈正比，所
3、以测定全血不能比测定血浆提供更多的信息。而全血的净化较血浆与血清复杂，尤其是溶血后，血色素等可能会给 HPLC 测定带来影响。但是，一些药物可与红细胞结合，或药物在血浆和红细胞的分布比率因人而异，在这些情况下，宜采用全血。血样抽取量受到一定的限制。人体药代动力学研究需要在多个时间点(一般为 1220 点) 取样，每次由前臂静脉取血 35m1。随着高灵敏度测定方法的建立，取样量可继续降低，从而更易为受试者接受。实验动物取血量应注意是否超过了动物的生理承受能力。制备血浆样品时，将采取的血样置含有抗凝剂的试管中，缓缓转动试管使其充分混合、离心，所得上清液即为血浆。常用的抗凝剂有肝素，它是体内正常的生
4、理成分，因而不会74改变血样的化学组成或引起药物的变化，一般不会干扰测定。通常 lml 血液采用 20 个单位的肝素即可抗凝。可将配制好的肝素溶液均匀地涂布在试管壁上，于 6070烘干备用。其它抗凝剂有柠檬酸、草酸盐、EDTA 等，但它们可能引起被测组分发生变化或干扰某些药物的测定。制备血清样品时，将采取的血样在室温下至少放置 3060min，待血液凝固后，以 30004000r/min 离心 10min，分取上层澄清的血清。血浆和血清在采血后应及时分离。短期保存时需置冰箱（4）中，长期保存时需置冰箱(-20以下 )冷冻备用。2.尿样的采集尿药测定主要用于药物剂量回收、药物代谢及生物利用度研究
5、，也可用于乙酰化代谢和氧化代谢快、慢型测定等。因为尿药浓度通常变化较大，所以应测定一定时间内排入尿中药物的总量，这就要同时测定在规定时间内的尿量(体积 )及尿药浓度。尿液的主要成分是水、尿素及盐类。它是一种良好的细菌培养基，因而需立即冷藏或防腐处理，否则细菌会很快繁殖而引起尿素分解，产生氨气，这在夏天进行得很快，除产生异常气味外，还有可能导致样品分解。冷藏条件一般可置 4冰箱内。若欲在室温下保存，应在收集尿样后，立即加入防腐剂。常用的防腐剂有甲苯、氯仿或改变尿液的酸碱性，以抑制细菌的繁殖。加入的防腐剂是否干扰测定或与被测组分发生化学反应，应由实验验证，以便选取合适的防腐措施。在所有体液样品中，
6、尿样最容易获得，并且样品量大，取样次数可以增加，内含药物(母体药物及代谢物)浓度高。健康人的尿液中不含蛋白质，不需除蛋白，所以常用作药物体内代谢研究。3.唾液样的采集由于某些药物在唾液中的浓度与血浆浓度密切相关，即可利用唾液中的浓度反映血浆中的药物浓度。由于唾液样品采集时无伤害、无痛苦，取样不受时间、地点的限制，因而样品容易获得。一般成人每日分泌唾液 11.5L。唾液的比重为 1.0031.008，粘度是水的 1.9倍；唾液的 pH 在 6.27.6 之间变动，分泌量增加时趋向碱性而接近血液的 pH。通常得到的唾液含有粘蛋白。唾液的采集应尽可能在剌激少的安静状态下进行，采集前应漱口，除去口腔中
7、的食物残渣，唾液自然分泌流入收集管中。采集后离心，分取上清液作为药物浓度测定的样品。也可采用物理方法(嚼石蜡片等 )或化学方法(广泛应用的是柠檬酸或维生素 C 等，有的将约7510mg 柠檬酸结晶放在舌尖上，或者将 10%的柠檬酸溶液喷在舌上，弃去开始时的唾液后再取样)刺激，使在短时间内得到大量的唾液，但这样可能影响唾液中的药物浓度。唾液中的粘蛋白决定了唾液的粘度，它是在唾液分泌后受唾液中的酶催化而生成的。为阻止粘蛋白的生成，应将唾液在 4以下保存。如果分析时没有影响，则可用碱处理唾液，使粘蛋白溶解而降低粘度。唾液在保存过程中，会放出 CO2，而使 pH 升高，需要测定唾液 pH 时，应在取样
8、时测定较好。冷冻保存的唾液解冻后应将样品混匀后使用，以免产生误差。需要指出的是只有知道唾液中药物浓度与血清中药物的总浓度有一定的比值时，唾液中药物浓度的监测才有意义。4.粪样的采集新鲜粪便收集之后应立即冷冻处理。因粪便内含有大量蛋白质，且微量药物包含在大量固体食物残渣中，对药物的分离和测定都带来麻烦。因此，必须采取蛋白变性处理及药物分离、纯化等措施。二、生物样品的储存由于实验设计的要求，如药代动力学研究，在一定的时间内必须采集大量的样品，受分析速度的限制，往往不能做到边采样边分析，需将部分样品适当储存。冷冻保存是最常用的方法。冷冻既可以终止样品中酶的活性，又可以储存样品。在某些情况下若收集的样
9、品来不及冷冻处理，可先将其置冰屑中，然后再行冷冻储存。冷冻时，若使用玻璃容器储存样品，需注意防止温度骤降使容器破裂，造成样品损失或污染。而塑料容器常含有高沸点的增塑剂，可能释放到样品中造成污染，而且还会吸留某些药物，引起分析误差。某些药物特别是碱性药物还会被玻璃容器表面吸附，影响样品中药物的定量回收，因此，必要时应将玻璃容器进行硅烷化处理。为防止含酶样品中被测组分进一步代谢，采样后必须立即终止酶的活性。常采用的方法有：液氮中快速冷冻、微波照射、匀浆及沉淀、加入酶活性阻断剂(通常加入氟化钠) 等。另外，某些生物样品中的药物易被空气氧化，如儿茶酚类中的阿朴吗啡，具有邻苯二酚结构，易被空气氧化产生醌
10、类杂质，若收集的血浆样品不加抗氧剂直接在l5冷藏，仅能稳定 4 周，但加入抗坏血酸后，则可稳定 10 周。又如卡托普利，由于采血后该药仍会被血浆中的酶继续氧化，使血药浓度大大降低，因而必须低温下立即分离出血浆并加入抗氧剂及稳定剂，以防止体外继续代谢。对于见光易分解的药物( 如硝苯地平) ，在采集生物样品时还需注意避光。76第二节 生物样品的预处理血浆(plasma)和血清(serum)是体内药物分析经常采用的样本，其中尤以血浆最为常用。因为药物在体内达到平衡状态时，血浆中药物浓度一般与药物在作用部位的浓度密切相关，可以反映药物在靶器官的状况。进行 HPLC 分析时，生物样品一般都需要进行纯化处
11、理。对纯化程度的要求，取决于使用的分析方法及样品所含杂质情况。仅有少数情况下可取样品直接进样，对于大多数样品而言，进行预处理是必要的。由于血药浓度一般很低(一般为 g/ml 或 ng/m1 水平) ，样品的基质、内源性物质及代谢产物相当复杂，若直接进行测定，内源性物质可能产生干扰，药物浓度太低会达不到仪器灵敏度要求。因此，生物样品中的药物一般须经过分离、纯化和浓集后再供测定。生物样品的前处理是色谱分析中必不可少的操作步骤，其目的可归纳为：(1)改善分析结果的准确度与精密度；(2)延长色谱柱的寿命(如除去固体杂质)；(3) 改善组分的可测定性(如被测组分的富集 )；(4)改善选择性(例如排除基质
12、干扰) ；(5)改变样品中组分的色谱行为。不管为了什么目的，在设计或执行某一个前处理步骤时都应考虑到下列问题：(1)被测组分的理化性质；(2)样品的化学组成；（3）药物的蛋白结合率；（4）基质干扰的类型；(5) 样品组分处理过程中的稳定性；(6)注意样品在收集、储存和前处理过程中容器的污染；(7) 适合色谱系统的样品最终使用的溶剂；(8)前处理过程尽量简单，有尽可能高的精密度和准确度；(9)前处理的最后一步应使被测组分富集等。为了对色谱分析中常用的前处理方法有比较全面的了解，下面就有关问题作进一步说明。一、样品均匀化对于血浆样品，应在测定前混合均匀，以免造成测定误差。可置涡流混合器上混匀，血浆
13、样品往复振摇亦可达到均匀化的目的。对粪便、肌肉和组织等固体样品都存在均匀化这一问题。对含有不溶性组分的样品(例如组织和粪便)，须将样品进行匀浆处理，以保证样品的均匀性。同时还应注意取样的代表性问题。二、去蛋白处理生物样品如血浆、血清等含有大量的蛋白质，它们能结合药物，因此对于某些药物的测定，必须先将与蛋白结合的药物游离之后再作进一步处理。测定血液、尿液和脑脊髓液77等体液中的药物时，因这些体液中含有蛋白质，在测定时会形成泡沫、浑浊或出现沉淀而干扰测定；用反相高效液相色谱法进行分析时，虽然可以直接进样，但体液中的蛋白质(以及脂类、盐类和其它内源性杂质)会沉结在色谱柱上，大大缩短色谱柱的寿命。如用
14、反相HPLC 测定血浆中的醋氨酚时，有人在分析柱前安装预柱，直接进样 l.5l 血浆样品，进样 500 次左右，便产生柱堵塞、柱效降低等现象。因此，生物样品去蛋白是必要的。通常去蛋白过程是将蛋白质变性处理后，把与蛋白结合的药物解离出来，离心分离以除去蛋白。目前已有很多去蛋白方法可供使用，但使用各种方法之前应了解该方法是否会导致生物样品中的药物发生分解或影响药物的提取等。通常除蛋白的方法是在含蛋白样品中加入适当的沉淀剂或变性剂，使蛋白质脱水而沉淀(如有机溶剂、中性盐) ，有的是由于蛋白质形成不溶性盐而析出(如一些酸类：三氯醋酸、高氯酸、磷酸、苦味酸) ，离心后取上清液用于分析。甲醇、乙腈、丙酮和
15、乙醇是沉淀蛋白常用的有机溶剂，中性盐有硫酸铵、氯化铵等。无机盐沉淀蛋白是可逆的，即将蛋白稀释后仍具有生理活性，而有机溶剂和酸类沉淀的蛋白是不可逆的，用甲醇沉淀蛋白的优点是上清液清澈，沉淀为絮状易于分离；乙腈与之相反，产生细的蛋白沉淀，但沉淀效率较甲醇高。甲醇与乙腈是反相液相色谱法中常用的蛋白沉淀剂，因为它们与流动相的组成相同。但若还需加有机溶剂提取，则由于加入的有机沉淀剂使水相和有机相部分混溶，会影响样品的提取效率。大多数药物在适当 pH 下可用有机溶剂直接萃取出来，同时，药物与血浆蛋白的结合处于可逆平衡状态，因此不必事先除去蛋白即可自体液中提取出药物。如普罗帕酮的血浆蛋白结合率在 95%以上
16、，在碱性条件下用有机溶剂即可从血浆中提取。直接用有机溶剂萃取药物，是实际操作中最经常使用的方法。由于该方法提取后有机相可吹干浓缩或用小体积水相反提富集，可提高检测灵敏度。透析法与超滤法也是除去样品中蛋白的方法。透析法很费时，溶质透过膜的程度与被测物的性质、温度有关，膜需常常更新，很难自动化，因此透析法一般不用于常规分析，而用于药物在生物样品中蛋白结合率的研究。与之相反，超滤法速度快，溶质转移影响因素小，还可用于样品的浓缩、脱盐、不同分子尺寸的分离、药物蛋白结合率的研究，但需使用特殊的装置，仅在个别情况下使用。三、被测组分的提取78生物样品中被测组分一般需提取后才能进行色谱分析，这一步骤包含了样
17、品的净化与浓缩。提取方法和提取条件的选择是分析方法研究的重要内容之一，它与分析方法的选择性、精密度和准确度紧密相关。1液-液提取液-液提取是经典的提取方法之一，它基于被测组分在不相混溶的两种溶剂中的分配。在提取过程中，水相的 pH 是重要的参数；有时加入一些强离子的无机盐( 如氯化钠)，利用盐析作用，能促进组分进入有机相。通过选择不同的有机溶剂可提高选择性。液-液提取可用于水为基质的样品中非极性或弱极性组分的提取，离子性化合物则采用水浴加热蒸发、减压蒸发、冷冻干燥等方法除去溶剂，残渣用与色谱方法相适应的溶剂溶解后进样。与其它方法相比，液-液提取法仍是目前最常用的样品处理方法，其原因是：通过萃取
18、可将被测组分自大量内源性物质中分离出来，减少杂质对测定的干扰；操作简单快速、经济实用；可将萃取液蒸发，使组分富集。残渣可用与 HPLC 相适应的溶剂溶解后进样，并且所加溶剂量应尽量少，以增加测定的灵敏度。当样品为酸性(或碱性) 时，可用小体积碱(或酸 )溶液将药物萃取入水相，调节适当 pH 进样，可达到富集目的，并且可进一步净化，有利于延长色谱柱的寿命；可一次进行多个样品的萃取。液-液提取有时会发生乳化现象以及被测组分损失。为了防止乳化，可应用较大体积的有机溶剂，避免猛烈振摇或加入适当的试剂改变其表面张力而破乳，若已发生严重的乳化现象，可将试管置于冰箱中冷冻破乳。如前所述，萃取过程中所用的玻璃
19、容器壁对某些药物的吸附是不可忽略的，特别是当药物浓度较低时更是如此。除对萃取所用的器具进行硅烧化处理以外，还常在萃取剂中加入异戊醇。异戊醇能减少玻璃壁的吸附，还可减少萃取过程中乳化的形成。也可以加入二乙胺，二乙胺能显著减少吸附作用，提高萃取回收率。两性药物或水溶性很强的药物不能用一般的溶剂萃取法将它们自体液介质中萃取出来，通常可用离子对萃取法。针对呈解离状态的药物，可以加入反离子来形成离子对络合物，再用有机溶剂萃取出来。2固相分离固相分离又称为固相提取柱法，是近十几年迅速发展起来的一种样品预处理技术，它是以液相色谱分离机制为基础建立起来的分离和纯化方法。与经典的液-液提取法相比，固相分离的优点
20、有：(1)快速，一般 12min 即可完成；(2) 回收率高，通常超过 90%，(3)精密79度比较好；(4)样品用量少，有一定的选择性，无乳化现象等。常用的柱填料有吸附剂、高分子大孔树脂、离子交换树脂、键合硅胶等。最简单的固相分离装置可以是一个玻璃(或塑料) 小柱甚至滴管，装入适当的填料 (固相提取剂) 。自制的固相提取小柱填充疏松，溶剂能自然流出。现在已经有许多不同形式的商品化固相提取小柱，如 Waters 公司的 SEP-PAK 子弹型柱， Analytichem Inter-national 公司的 Bond Elut 管型柱和天津市经济技术开发富集色谱技术发展公司的 MT 型样品净化
21、富集柱。大多数商品化柱都是尖头的聚丙烯管，底部压缩装入 l00500mg 的填料。固相分离有两种实现样品纯化的途径。一种是保留杂质，待测组分不被保留而自然流出或者被洗脱。更为常用的一种途径是先使待测物完全保留在柱上，使干扰杂质随样品溶剂或洗涤液洗出，然后以小体积溶剂洗脱待测物。键合硅胶固相提取的一般操作步骤如下：以适当强溶剂湿润固相提取填料使其溶剂化；以弱溶剂通常是水或缓冲溶液洗涤填料，使其达到良好的分离状态；将溶于弱溶剂常是缓冲溶液中的样品加到固相提取柱上；以强度适当的弱溶剂，如含有少量甲醇的水或缓冲溶液，洗涤、除去基质或干扰组分；用强度较高的溶剂洗脱待测组分，收集洗脱液，直接或适当浓缩后进
22、行色谱分析。为了确立最佳固相提取条件，使方法有良好的选择性、准确度和重现性，在实验、实践中应当从下列各方面着手：首先要研究待测组分(药物等 )的物理、化学性质，根据这些性质选择合适的固相提取剂，然后根据待提取组分的性质和已选用的提取剂来选择洗脱剂；再了解样品基质的性质，这有助于选择上样前固相提取剂的平衡溶剂、样品溶剂和消除杂质用的洗涤溶剂，最后进行回收率试验，考察提取的完全程度。3柱切换技术柱切换技术是色谱分析中处理复杂样品的方法之一。利用切换阀改变不同的色谱系统，达到在线样品净化、组分富集等目的。两个不同液相色谱柱之间的切换称为液相色谱切换法，对生物样品的药物分析特别有用，具有很大潜力。液相
23、色谱柱切换法实为一种在线的固相分离技术。常用一种长 35cm，填以粒径 2540m 填料(类型取决于待测物的保留能力)的预处理柱，选择一个低溶剂强度的预处理流动相使生物样品净化、富集；切换阀启动后，分析流动相将组分带入分析柱分离与测定，测定结束后仪器自动恢复准备下次进样，严格按预先设定的程序执行。较之上述提取方法，液相色谱柱切换法的优点有：(1)操作简单，全自动化，含蛋白样品可直接进样或简单地沉淀蛋白离心后即可进样。(2)分析结果精密度高，一般无须内标。进样体积一般为 0.21.0m1（血浆、血清因粘度较大，需稀释后进样） ，在线处理全过程由计算机程序控制。每个样品在同一预柱的相同条件下处理，
24、分80析结果的 RSD 一般小于 5%。(3)适于不稳定样品，如易光解、热不稳定样品的分析。全部过程在封闭状态下进行，避免了分离、浓缩等操作。(4)富集作用提高了检测灵敏度。尤其是极性较大的组分，无法用液-液萃取时，HPLC 柱切换技术特别奏效。利用组分在预柱上的保留作用，可将采集的样品几乎全部注入色谱仪。在进样后至下一次进样之前常需注入净化清洗液，例如在样品测定中，以 0.2mo1/L 醋酸-醋酸铵为净化清洗液，使预处理柱再生，清除预处理柱、样品环和管道中的残留物和杂质。在小心维护的情况下(防止沉淀注入) ，可延长预柱的使用寿命。4其它纯化方法近年来，在用 HPLC 作生物样品中药物分析在线前处理方面还出现了浸透限制固定相(restricted access stationary phases)和含表面活性剂流动相等方法。前者是指蛋白质等大分子不能穿透进入其憎水孔内袋中，而药物及其代谢物等小分子化合物则可不受限制自由出入固定相，大分子物质如蛋白质，在色谱的死体积中被排出，避免了对色谱柱的破坏和对药物测定的干扰，而药物及其代谢物等小分子化合物则可到达固定相的憎水部位而得到分离。因而可以将血浆或血清样品直接注入，不必经除蛋白和萃取等步骤。
