1、1课程名称： 现代生物技术概论授课主题： 第四章 发酵工程授课教师：生命科学系 王国霞目的要求：掌握发酵工程的基本类型和基本原理，了解典型发酵产品的生产工艺，认识发酵的基本过程及常用的发酵设备。 内容重点与难点：发酵设备、发酵过程、发酵条件的控制 第一节 发酵工程概况1、定义发酵工程是生物技术的重要组成部分，是生物技术产业化的重要环节。它将微生物学、生物化学和化学工程学的基本原理有机地结合起来，是一门利用微生物的生长和代谢活动来生产各种有用物质的工程技术。又称为微生物工程。目前，人们把利用生物细胞的生命活动来制备目的产物的过程统称为发酵。发酵：利用微生物的生命活动来制备微生物菌体或其代谢产物的
2、过程发酵工程：指利用微生物的特定性状，通过现代工程技术，在生物反应器中生产有用物质的一种技术系统。发酵工程是“ 研究利用微生物的工业，即微生物参与的工艺过程” 。2、发酵工程的发展历史（1）自然发酵阶段。发酵技术有着悠久的历史，早在几千年前，人们就开始从事酿酒、制酱、制奶酪等生产。（2）纯培养技术的建立。（3）深层通风培养技术的建立。（4）代谢控制发酵技术的建立。（5）固定化酶技术、细胞工程技术、基因工程技术的建立。纵观生物技术的发展历史，我们可以知道，生物技术在经历了漫长的以传统工艺技术为主体的时期以后，正向系统的理论和实际应用相结合的方向发展，即奠定了可靠的理论和实践基础，也为今天和今后相
3、当长时期生物技术的产业化准备了条件。3、发酵工程在现代生物技术中的地位和作用2发酵工程是生物技术产业化的基础和关键技术，是生物技术四大支柱的核心，无论传统发酵产品，如抗生素、氨基酸等，还是现代基因工程产品，如疫苗、人体蛋白质等，都需要发酵技术进行生产。在发达国家，发酵工业的产值占国民生产总值的 5%。在医药产品中，发酵产品的产值占 20%。在医药、食品、化工、冶金、资源、能源、环境等诸多领域有着广泛的应用。4，发酵工程的内容菌种的选育发酵条件的优化与控制反应器的设计产物的分离、提取与精制5，发酵类型（1） 微生物菌体发酵：以获得某种用途的菌体为目的的发酵。传统的菌体发酵有酵母发酵（用于面包馒头
4、制作）和微生物菌体蛋白发酵（用于人类食品和动物饲料）两种。现代的菌体发酵有用于制药行业的药用真菌生产（如香菇、冬虫夏草、茯苓菌等） ，还有用于制造生物防治剂和杀虫剂的微生物菌体（苏云金杆菌等） 。（2） 微生物酶发酵 ：微生物产酶种类多、品种多、生产容易和成本低等优点。（3） 微生物代谢产物发酵：初级代谢产物：在菌体对数生长期所产生的产物，如氨基酸、核苷酸、蛋白质、核酸、糖类等，是菌体生长繁殖所必需的，这些产物叫做初级代谢产物。 次级代谢产物：在菌体生长静止期，某些菌体能合成一些具有特定功能的产物，如抗生素、生物碱、细菌毒素、植物生长因子等。这些产物与菌体生长繁殖无明显关系，叫做次级代谢产物。
5、 （4） 微生物的转化发酵 ：利用微生物细胞的一种或多种酶，把一种化合物转变成结构相关的更有经济价值的产物。（5） 生物工程细胞的发酵：利用生物工程技术所获得的细胞，如 DNA 重组的工程菌进行的新型发酵。工程菌胰岛素、干扰素等，杂交瘤细胞单克隆抗体36，发酵工程的应用（1）医药工业。 （2）食品工业， （3）能源工业， （4）化学工业， （5）冶金工业，（6）农业， （7）环境保护。第二节 微生物发酵过程一，发酵类型微生物发酵过程即微生物反应过程，是指由微生物在生长繁殖过程中所引起的生化反应的过程。 （1）好氧性发酵：在发酵过程中需要不断地通入一定量的无菌空气。（2）厌氧性发酵：在发酵时不需
6、要供给空气。（3）此外，还有兼性厌氧微生物，如酵母缺氧进行厌氧性发酵生产酒精，有氧通气条件下进行好氧性发酵，大量繁殖菌体细胞，因此称为兼性发酵。根据培养基条件的不同，分为固体发酵和液体发酵。按发酵设备分类，又可分为敞口发酵、密闭发酵、浅盘发酵和深层发酵。敞口发酵：用于繁殖速度快的好氧发酵类型，酵母密闭发酵：工艺复杂，要求严格浅盘发酵：一薄层培养液以培养菌体，好氧深层发酵：在液体培养基内部进行的微生物培养。是在青霉素等抗生素的生产中发展起来的技术。优点：（1）液体悬浮状态是很多微生物的最适生长环境；（2）在液体中，菌体、营养物及产物均易于扩散，便于控制；（3）输送方便，便于机械化操作；占地面积小
7、，生产效率高，产品质量稳定；（4）产品易于提取、精制等。二、发酵工业中常用的微生物发酵工业常用的微生物：细菌：细菌是自然界中分布范围最广、数量最多的一类微生物，属单细胞原核生物，以较典型的二分裂方式繁殖。放线菌酵母菌4霉菌由于发酵工程本身的发展以及基因工程的介入，藻类、病毒等也正在逐步地变为工业生产用的微生物。三、培养基（一）培养基的配制原则 （1）目的要明确。（2）培养基的营养要协调（3）pH 要适宜。（二）分类1，孢子培养基:制备孢子基质浓度低，尤其是有机氮源。常用的孢子培养基:麸皮培养基 、大（小）米培养基、琼脂斜面培养基2，种子培养基:供孢子发芽和菌体生长繁殖营养成分丰富完整，氮源和维
8、生素的含量略高，总浓度稀薄3，发酵培养基：提供菌体生长和合成代谢产物组成丰富完整，营养成份浓度和粘度适中，利于菌体的生长，便利合成大量的代谢产物 （三）培养基的基本成分 1、碳源：转变为微生物的细胞物质和代谢产物。 是构成菌体和产物的碳架及能量来源。主要利用的碳源有单糖、饴糖、糖蜜、淀粉、麸皮、米糠等。 纤维素为碳源来培养微生物 2、氮源凡是构成微生物细胞本身的物质或代谢产物中氮素来源的营养物质都是氮源。是微生物发酵中使用的主要原料之一。常用的氮源包括有机氮源和无机氮源两大类。3、无机盐和微量元素主要生理功能：作为酶活性中心的组成部分5维持生物大分子和细胞结构的稳定性调节并维持细胞的渗透压平衡
9、作为某些微生物生长的能源物质等； 微量元素必须控制在正常范围，一般 0.1ug/ml 的浓度就可以。4、生长因子是微生物维持生命不可缺少的，是细胞自身不能合成的有机化合物。三大类：维生素类、氨基酸、嘌呤与嘧啶。酵母膏、牛肉膏、蛋白胨、动植物组织的浸液（心脏、肝、番茄、蔬菜的浸液 )5、水6、产物形成的诱导物、前体和促进剂7、生长促进剂四、发酵的一般过程包括菌种制备、种子培养、发酵和提取精制等几个过程。1，菌种的选育要想通过发酵工程获得在种类、产量和质量等方面符合人们要求的产品，最重要的是要有优良的菌种。可以从自然界中先分离出相应的菌种，再用物理或化学的方法使菌种产生突变，从突变个体中筛选出符合
10、生产要求的优良菌种。可用基因工程、细胞工程的方法对菌种的遗传特性进行定向改造，以构建工程细胞或工程菌，从而达到生产相应产品的目的 2，种子扩大培养 将保存在砂土管、冷冻干燥管或冰箱中处于休眠状态的生产菌接入试管斜面培养基上活化，再经过茄子瓶或摇瓶及种子罐逐级扩大培养，获得一定数量和质量的纯种，这个全过程称为种子扩大培养，这些纯种培养物称为种子。3，发酵：全程无菌4，下游处理：对发酵产物进行分离精制成产品的过程第三节 液体深层发酵一、发酵操作方式6根据操作方式的不同液体深层发酵主要有三种方式：分批发酵、连续发酵、补料分批发酵。（一）分批发酵：营养物和菌种一次加入进行培养，直到结束放出，中间除了空
11、气进入和尾气排出，与外部没有物料交换。 只对温度和 PH 值和通气进行控制，其他不管，操作简单。传统的生物产品多为这种过程。其全过程包括空罐灭菌、加入已灭菌的培养基、接种、发酵过程、放罐和洗罐，所需时间的总和为一个发酵周期。分批发酵是一个有限的时间内在一个封闭系统内完成的，是限制性生长，有典型的生长周期。（二）连续发酵是指以一定的速度向发酵罐内添加新鲜培养基，同时以相同的速度流出培养液，从而使发酵罐内的液量维持恒定，微生物仍在稳定状态下生长。 优点：发酵周期长，产量高缺点：会引起菌种退化（三）补料分批发酵补料分批发酵又称为半连续发酵，是介于分批发酵和连续发酵之间的一种发酵技术，是指在微生物的分
12、批发酵中，以某种方式向培养系统补加一定物料的培养技术。 两种方式：单一补料分批发酵： 反复补料分批发酵 ：兼有分批发酵和连续发酵的优点，克服了两者的缺点，同分批发酵比：解除了营养物基质的抑制，产物反馈抑制和葡萄糖分解阻遏效应（葡萄糖被快速分解代谢所积累的产物在抑制所需产物合成的同时，也抑制其他一些氮源和碳源的分解利用。 ）与连续发酵比：不会产生菌种老化和变异问题，其通用范围也比连续发较广。 二、发酵工艺控制无论是什么样的发酵方式，都需要对发酵的各种参数进行控制，发酵参数按性质分：7物理参数（温度、空气流量、搅拌转速、密度等）化学参数（酸碱度、溶氧值、CO2 浓度、各种营养成分浓度等）生物参数（
13、菌体浓度、菌体成分、蛋白质含量、细胞形态等）按能否直接测量分：直接参数：可直接被特定的传感器检测的参数。间接参数：不能直接测定出来，要根据测定的某些直接参数进行模拟计算得到的。1，温度温度对发酵过程的影响是多方面的，它会影响各种酶反应的速率，改变菌体代谢产物的合成方向，影响微生物的代谢调控机制。除这些直接影响外，温度还对发酵液的理化性质产生影响，如发酵液的黏度、基质和氧在发酵液中的溶解度和传递速率、某些基质的分解和吸收速率等，进而影响发酵的动力学特性和产物的生物合成。 2，pH 值pH 值对微生物的生长繁殖和产物合成的影响有以下几个方面： 影响酶的活性，当 pH 值抑制菌体中某些酶的活性时，会
14、阻碍菌体的新陈代谢； 影响微生物细胞膜所带电荷的状态，改变细胞膜的通透性，影响微生物对营养物质的吸收及代谢产物的排泄；影响培养基中某些组分和中间代谢产物的解离，从而影响微生物对这些物质的利用；pH 值不同，往往引起菌体代谢过程的不同，使代谢产物的质量和比例发生改变。另外，pH 值还会影响某些霉菌的形态。3 ，溶解氧浓度对于好氧发酵，溶解氧浓度是最重要的参数之一。好氧性微生物在进行深层培养时，需要适量的溶解氧以维持其呼吸代谢和某些产物的合成，氧的不足会造成代谢异常，产量降低。现在可采用复膜氧电极来检测发酵液中的溶解氧浓度。发酵前期给氧水平要有利于菌体生长，中后期要利于产物的形成。4，培养基直接影
15、响微生物生长和产物的合成培养基灭菌是关键 多采用短时间高温处理的灭菌方法 8三、 发酵设备发酵设备： 在发酵工业上进行深层反应的设备。生产上使用的几种发酵罐类型 1、机械搅拌式发酵罐 2、通风搅拌式发酵罐运用最广泛的是机械搅拌式发酵罐优点：（1）操作灵活（2）容易购买（3 ）气体运输效率高（4）适用于各种微生物发酵（一）机械搅拌式发酵罐 机械搅拌式发酵罐是发酵工厂常用的类型之一。它是利用机械搅拌器的作用，使空气和发酵液充分混合，促进氧的溶解，以保证供给微生物生长繁殖和代谢所需的溶解氧。 1，通用式发酵罐指既具有机械搅拌又有压缩空气分布装置的发酵罐。罐体立体圆筒形，有一定比例，封闭式，多用涡轮式
16、搅拌器。2，自吸式发酵罐构造：带中央吸气口的搅拌器,由罐底向上伸入的主轴带动（二）通风搅拌式发酵罐在通风搅拌式发酵罐中，通风的目的不仅是供给微生物所需要的氧，同时还利用通入发酵罐的空气，代替搅拌器使发酵液均匀混合。常用的有循环式通风发酵罐和高位塔式发酵罐 （三）厌氧发酵设备发酵液尽量装满有时还需充入非氧气体排气口安装水封装置培养基应预先还原9使用大剂量接种四、下游加工过程发酵完成以后的发酵液是混合物，里面除了我们想要得到的目的产物外还有残留的培养基和发酵过程中产生的各种杂质，因此，对发酵产品必须进行分离和纯化，也就是我们通常说的发酵工程的下游处理过程。过去，人们对这个问题有所忽视，因而使其称为
17、只要发酵工程良性发展的一个瓶颈问题，现在已经引起许多科学家的重视，而成为一个全新的技术领域，及产品后处理工程。从发酵液到产品一般要经历几个步骤：1、发酵液预处理和固液分离2、提取3、 精制 4、成品加工 （一）发酵液预处理和固液分离纯化的第一步就是把微生物细胞与培养基分开。因为发酵液成分复杂，黏度较大，在收获微生物前，一般要进行预处理。对发酵液的预处理包括以下几个方面，（1）加热，这种方法仅适用于对非热敏感性产品发酵液的预处理。（2）调节 PH 值。适当的 PH 值可以提高产物的稳定性，减少其在随后的分离纯化过程中的损失。（3）加入絮凝剂。预处理后，可以通过过滤的方法收获菌体。但大规模发酵液的
18、收获一般用高速离心或微孔滤膜过滤的方法。微生物细胞的破碎细胞破碎方法既要能破坏细胞壁，又要保证蛋白产物不发生变性1、化学及生物学方法化学方法应用各种化学试剂使细胞膜的结构改变或破坏的方法NaOH 处理大肠杆菌，有机溶剂生物方法（酶处理法）2、 物理方法 10非机械的方法 ：如渗透压法、反复冻融法 机械的方法 超声波破碎、湿磨、高压匀浆及撞击 ，破碎效率高湿磨法常用于破碎大量细胞。（二）提取通过低速离心或者微过滤法除去细胞碎片，或者有机溶剂沉淀蛋白。交叉流过滤法，蒸发，萃取等对蛋白产物进行初步纯化。（三）精制用途决定纯度。有时候，蛋白粗提取物就可以作为产品，有些则对产品要求较高。如药用等。必须要
19、进行提纯精制。对发酵产物的进一步纯化常采用层析法，包括吸附层析法，离子交换法，分子筛层析法和亲和层析法等。（四）成品加工在完成分离纯化之后，还要根据产品的要求，进行浓缩、无菌过滤和去热源，干燥，加稳定剂等。干燥一般采用喷雾干燥法，气流干燥法，冷冻干燥法等，冷冻干燥效果最好。第四节 固体发酵固体发酵：某些微生物的生长需水很少，可以利用疏松而含有必需营养物的固体培养基进行发酵生产.传统的酿酒工艺，制酱工艺，菌类养殖，泡菜等第七节 典型产品的发酵生产青霉素是抗菌素的一种，是从产青霉素的霉菌培养液中提制的药物，是第一种能够治疗人类疾病的抗生素。青霉素的发现者是英国细菌学家弗莱明。 最初由弗莱明分离的点青霉，在 1943 年刚开始生产青霉素时，青霉素的含量只有2U/mL 左右目前全世界用于生产青霉素的高产菌株是 WisQ1176 (一种产黄青霉）经过长期的诱
