1、中华生物竞赛网 中华生物竞赛网 大肠杆菌杂交及基因定位实验一、原理大肠杆菌染色体呈环状。高频重组菌株（Hfr）的染色体上整合有 F 因子，当 Hfr 细菌与 F细菌细胞发生接合（即杂交）时 Hfr 细胞（供体菌）的染色体从 Hfr 细胞向 F细胞内转移。由于染色体的转移具有一定的方向性，并且可以随时中断，因此根据结合后 F细菌（以重组子形式选出）中 Hfr 细菌染色体基因出现次数的多少，即可得知基因转移的先后顺序，也就是说基因在染色体上排列的顺序。转移时，靠近转移起始点的染色体基因进入 F细胞的机率大，重组频率高，远离转移起始点的基因进入F细胞的机会少，重组率低，F 因子大部分位于转移起始点相
2、对的一端（末端）。因此转移的频率很低。只有当接合时间很长，足以使整个染色体转入 F细胞（受体）时，才会使 F细胞转变为 Hfr 或 F状态。基因定位时首先要从 Hfr 与 F细菌的混合培养物中筛选出某一 Hfr 与 F细菌基因（选择性标记基因）已经发生了重组的细菌（重组子），然后在这些重组子中逐个测定其它的 Hfr 基因（非选择标记）出现的次数。Hfr 菌株染色体上的选择性标记应位于染色体前端，这样才能保证以 100的频率出现在重组子中。选择性标记之后的基因，则以低于 100的频率出现在重组子中。F细胞的选择性标记应起到排除 Hfr 菌生长的作用（即反选择）。本实验使用的 F菌株为 Strr,
3、Hfr 菌为 Strs,借此可排除 Hfr 菌的生长。另一方面为保证 Hfr 基因有机会出现在重组子中，反选择性标记应位于染色体后端。为了使 Hfr 菌株有较高的接合频率，F细菌应该过量以保证每一个 Hfr 细菌都能与 F细菌接合（1020：1）。二、目的通过本实验，了解大肠杆菌杂交及其基因在染色体上的排列方式，并掌握大肠杆菌接合及染色体基因定位的原理与方法。三、材料、试剂与器具1、受体菌：FD1004FleupurEtrphismetAilvargthiaralacYxylmtlgalTstrrrifr 。2、供体菌：CSH60Hfrsupstrs。3、生理盐水：0.85%NaCl 。4、1
4、0A 缓中液。中华生物竞赛网 中华生物竞赛网 5、基本培养基。6、LB 培养基。7、选择培养基BG ：基本培养基加氨基酸（表 12）。8、培养皿、三角瓶、吸管、灭菌牙签、摇床、酒精灯、接种环。四、操作步骤1、第一天傍晚，分别接一环供体菌和受体菌于 5mlLB 培养液中，37振荡培养 1012 小时。2、第二天清晨，各取 1ml 过夜培养物，分别加入到 2 个盛有 5mlLB 培养液的 250ml 三角瓶，37振荡培养 23 小时。3、吸取 0.5ml 供体菌和 4.5ml 受体菌，加入到一个无菌的 250ml 三角瓶中混合，置 37摇床上培养100 分钟。4、将上述接合菌液用生理盐水稀释 10
5、0、10-1、10-2 倍。5、各吸取 0.1ml 稀释液涂布在选择培养基 A平板上，每一种稀释液涂布 2 个平板。同时将供体菌及受体菌分别吸取 0.1ml 涂布在 A上作对照，每种各 2 个平板。此后均于 37条件下培养 48 小时。6、第四天，1）观察和计数选择培养基A平板上接合组和对照组的菌落生长状况；2）在与平皿相同大小的白纸上画 100 个小格，将圆片贴于选择培养基B、C、D、E、F和G 平板的底部，然后用灭菌牙签从接合组选择培养基A平板上随机挑选 100 个菌落，对号点种在选择培养基B、C、D 、E、 F和G平板的 100 个小格中；3）将所有平板置于 37箱内培养 48 小时。7、第六天，统计在各种选择平板上生长菌落的数目，记录。并绘制出基因顺序图。选择性培养基附加成份表中华生物竞赛网 中华生物竞赛网
