感染性疾病及免疫学检测.ppt

常见病毒性传染病及其免疫学检测,平顶山市妇幼保健院,传染病：是病原体以某种方式进入到人体后，并在人体内生长繁殖，释放毒素或导致机体内微生态平衡失调，给人体的组织和器官造成一定的损伤而引起的疾病。,,病原体,易感人群,免疫学检验主要用于：,辅助诊断及鉴别诊断,判断疗效及预后,流行病学调查,常用的免疫学检测方法,酶联免疫吸附试验（ELISA） 金标法（试纸条、试纸板） 化学发光法 1.电化学发光（罗氏） 2.微粒子化学发光（雅培） 免疫印迹法 (Western blotting)  凝集反应（梅毒检测),酶联免疫吸附试验ELISA （enzyme linked immunosorbent assay） 是一类常用的免疫酶技术。是将已知的抗原或抗体吸附在固相载体表面，使抗原抗体反应在固相表面进行。 常用的酶：辣根过氧化物酶(HRP) 碱性磷酸酶（AP）。,基本步骤,包被 封闭 孵育 洗涤 显色 结果测定 缺点：1只是诊断的辅助手段，特异性和灵敏性有待提高。2操作过程有些繁琐，反应时间过长，不能一蹴而就。,金标法,原理：金标层析法采用双抗原夹心法免疫测定原理，选择经纯化的基因工程制备的抗原，分别作为包被抗原和胶体金结合抗原。由于层析作用反应复合物沿硝酸纤维膜向前移动，当遇到包被抗原时，形成红色沉淀线。在包被膜上还有一条质控线对照，故当有两条红线时判为阳性，只有一条红线时，判为阴性。,免疫印迹法,免疫印迹法 (Western blotting) 是一种将高分辨率凝胶电泳和免疫化学分析技术相结合的杂交技术。免疫印迹法具有分析容量大、敏感度高、特异性强等优点，是检测蛋白质特性、表达与分布的一种最常用的方法。（病毒学检测主要用于检测HIV抗原确证试验）,凝集反应,凝集反应是指颗粒抗原与相应抗体结合反应出现的可见性现象。颗粒抗原如完整的细菌、红细胞等与相应抗体相混合，在一定条件下出现凝集。,化学发光免疫分析chemiluminescence immunoassay（ CLIA）,CLIA是将化学发光分析和免疫反应相结合而建立的一种新的免疫分析技术。 这种方法兼有发光分析的高灵敏度和抗原抗体反应的高度特异性。,CLIA优越性,高度敏感，可达pg／ml或pmol水平； 特异性强，重复性好，CV＜5％。 测定范围宽，可达7个数量级。 试剂稳定，无毒害，无污染，有效期长，达数月甚至数年。 操作简单，耗时短，易于自动化。 在对环保很重视的国家，CLIA成了取代RIA的首选方法。,常见术前检测,甲型肝炎抗体（抗HAV IgM） 乙肝五项 丙型肝炎抗体 （抗HCV) 梅毒螺旋体抗体 人类免疫缺陷病毒抗体（抗HIV）,病毒性肝炎,Viral Hepatitis是由一组嗜肝病毒引起的，以肝脏炎症和坏死病变为主的一种传染病。主要表现为明显的消化道症状、全身疲乏无力，肝脏肿大。肝功能异常，部分病例出现黄疸。,甲型病毒性肝炎（HAV）,HAV属小RNA病毒，为正单链RNA病毒。HAV主要经粪-口途径传播。潜伏期平均28天。 HAV抵抗力较强，60℃加热10-12h后仍具有感染性，85 ℃加热立即灭活，对乙醚、氯仿及PH为3的酸性环境有抵抗力。,HAV,,IgM：近期感染HAV,发病2周后阳性 率为100%，3个月后转阴。早期诊断。,IgG：急性感染后6个月达高峰，然后逐渐下降，可终身存在。既往感染HAV,RNA：早期诊断的特异性指标,,HBV (hepatitis B virus）乙型肝炎病毒,,我国流行现状,现有HBV感染者约1.6亿,,HBV颗粒,管型,小球型,大球型,,HBV特点,HBsAg与HBsAb,HBeAg与HBeAb,HBcAg与HBcAb,有包膜双股DNA病毒,三组Ag-Ab系统：,,,,HBs-Ag,是感染的标志,见于体液和分泌物中，也可见于唾 液、精液、乳汁中,介导病毒结合肝细胞,HBs-Ab,3-6个月产生,有抵抗力的标志,阻断病毒结合肝细胞,,,HBeAg,病毒复制的标志，传染性强,病毒合成后释放到血液中,治疗的参考指标,HBeAb,病毒复制减少的标志，传染性弱,要先于HBsAb出现,,,HBcAg,存在于病毒核心，不释放至血液,抗原性强,HBcAb,出现早，消退晚,IgM: 近期感染HBV,IgG: 既往感染HBV,临床组合模式,乙肝五项少见模式分析,单一HBsAg： 主要见于急性HBV感染的最早期，一般随之出现HBeAg和IgM的Anti-HBc。通常的慢性HBV感染中，HBsAg和Anti-HBc并存者约占95%，HBV慢性感染中不出现Anti-HBc是少见的。单一的HBsAg的异常表现主要由于Anti-HBc的缺失。,HBsAg和Anti-HBs并存： 在HBV感染恢复期中约有3%的个例可同时检出HBsAg和Anti-HBs,然后HBsAg消失而Anti-HBs水平逐渐升高。在慢性HBV感染者中约3%-5%两者共存，出现Anti-HBs并不表明HBsAg的清除和感染的恢复，可能由于： 1.前后感染两种亚型HBV，或HBsAg与其抗体之间仅有低亲和性反应； 2.S基因变异，其编码的HBsAg抗原性改变，原型Anti-HBs不能将其清除； 3.α 干扰素治疗中出现Anti-HBs血清转换，也因S基因的变异，而未能清除HBsAg。 4.HBV疫苗接种者中也有少数个例虽有正常的Anti-HBs应答，但仍能感染α决定簇变异的免疫逃逸病毒株，从而出现与HBsAg共存的现象。,HBeAg和Anti-HBe并存： 一般是处于乙肝e抗原和e抗体转换时期，e抗原和e抗体以抗原抗体复合物的状态共存。Anti-HBe试剂检测时，血样中的抗原抗体复合物同样可以结合至包被板上，起到了竞争效果。,呈世界性分布,极易慢性化，与肝硬化、原发性肝癌 关系密切,HCV （hepatitis C virus）丙型肝炎病毒,,HCV特点,有包膜的单股正链RNA病毒,抗HCV抗体非保护性抗体,输血和非肠道途径传播,,主要检测IgG,丙型病毒性肝炎(HCV)临床意义,HCV是输血后肝炎和散发性非甲非乙型肝炎的主要病原。HCV感染后可导致慢性肝炎、肝硬化和肝细胞癌等多种肝脏疾病。抗HCV阳性而血清中没有HCV RNA提示既往感染。,检测方法,常用检测方法为ELISA法，金标记免疫层析法和化学发光法。,检测方法：,ELISA,化学发光,HIV (Human Immunodeficiency Virus)人获得性免疫缺陷病毒,我国历年艾滋病病毒感染者和病人数,HIV的结构特点,,HIV-1和HIV-2,逆转录病毒,两股相同的正链RNA,,,,CD4+ 细胞,HIV gp120 结合CD4 / 辅助受体,病毒经黏膜或皮肤破损进入体内 感染黏膜或皮肤层树突状细胞 病毒于24小时内在树突状细胞繁殖 病毒于24-28小时到达局部淋巴结 病毒于5天内出现在外周血液中 每个感染细胞可产生5000个病毒颗粒，每人每天可产1010病毒。,HIV的检测,筛选试验：敏感性高，如ELISA，胶体金标记层析法。,确诊试验：特异性高，如蛋白印迹试验和IFA,抗体最早在感染后二周，最晚三个月会转为阳性,初筛试验2次阳性，再进行确认试验,,结果判断,确诊试验阳性，有临床症状，诊断为AIDS,确诊试验阳性，无临床症状，诊断为HIV感染者,,确诊试验阴性，但初筛试验阳性或有临床症状， 3个月后复查,,梅 毒 syphilis,是梅毒螺旋体引起的一种慢性传染病，本病的特点是病程的长期性和潜匿性，病原体可侵犯任何器官，临床表现出各种不同的症状。,三个阶段,一期梅毒：硬性下疳； 二期梅毒：梅毒疹； 三期梅毒：累及心、肝、神经系统、骨等。,后天性梅毒（获得性）： 95%性交 传播，少数因输血、接吻、医务人员不慎受染等直接接触传播。 先天性梅毒（胎传梅毒）： 梅毒螺旋体可自患病母体的血液经胎盘传给胎儿,传播方式,非梅毒螺旋体抗原血清试验：是以心磷脂、卵磷脂及胆固醇作为抗原检查血清中的反应素，用于初筛试验及疗效观察。可以分为以下四种试验，原理基本相同： 1、性病研究实验室玻片试验（VDRL) ：由于试剂需现配 现用，故而国内实验室很少采用。但VDRL是唯一可用于神经性梅毒诊断的血清学方法 2、快速血浆反应素环状卡片试验 (RPR)：在特制的纸片 上进行，加入一定量特制的炭粉，可使抗原抗体出现 凝集，用肉眼可观察结果。 3、甲苯胺红试验（TRUST)：在试剂中加入甲苯胺红代替炭粉 颗粒，使结果更易于观察。 4、不加热血清反应素试验（USR),梅毒的血清学试验（一）,RPR,TRUST,VDRL,非梅毒螺旋体抗原血清学试验结果判断,滴度：出现凝集反应的血清最高稀释倍数。,非梅毒螺旋体抗原血清试验的缺陷： 1、特异性：由于在多种疾病，如急性病毒性感染、自身免疫 性疾病、结缔组织病、静脉吸毒者以及怀孕妇女中均可出现反应素，所以此类试验有时会出现假阳性反应. 2、敏感性：非梅毒螺旋体抗原血清试验有时出现弱阳性或阴性结果，而临床上又像二期梅毒，此时应将此血清稀释后做定量试验，如出现阳性结果，则为抗体过量引起的前带现象。1－2％二期梅毒病人可出现此现象而发生梅毒血清假阴性反应。此外，由于感染梅毒后反应素的出现晚于特异性梅毒螺旋体抗体，晚期梅毒反应素又可能转阴，因此这类试验不适于一、三期梅毒，对隐性梅毒和神经梅毒也不敏感。因此此类试验做梅毒初筛时，存在一定数量的漏检. 非梅毒螺旋体抗原血清试验的优点： 1、非梅毒螺旋体抗原血清试验表现为滴度随疗程逐渐下降，故可以作为疗效观察的指标 2、此类方法价格低廉,梅毒的血清学试验（二）,梅毒螺旋体抗原血清试验：用梅毒螺旋体作为抗原检测血清中的抗螺旋体IgM和/或IgG抗体，其敏感性和特异性均较高。常用的有以下五种方法： 1、荧光梅毒螺旋体抗体吸收试验（FTA-ABS) 2、梅毒螺旋体血球凝集试验（TPHA） 3、梅毒螺旋体明胶凝集试验（TPPA) 4、梅毒螺旋体酶联免疫吸附试验（TP-ELISA） 5、梅毒螺旋体快速诊断试验（TP-RT）,梅毒的血清学试验（三）,梅毒螺旋体明胶凝集试验（TPPA） 原理： TPPA的原理与TPHA基本相同，它以人工合成的 惰性明胶颗粒代替TPHA试验的红细胞作为载体， 是TPHA的升级产品 优点： 1、试剂稳定，批间差小 2、结果判读更为清晰明确 3、敏感性和特异性较TPHA进一步提高 4、通过了国家的批批检 不足：结果判定主观，较难实现自动化,梅毒的血清学试验（四）,赛乐迪亚（Serodia）TPPA 梅毒螺旋体抗体明胶颗粒凝集试验,梅毒螺旋体酶联免疫试验（TP-ELISA） 原理：以梅毒螺旋体抗原包被聚丙乙烯板，再加入待检 血清以及酶标抗原，形成双抗原夹心，同时检测 IgG、IgM抗体。少数试剂采用间接法，检测IgG 优点：1、敏感性和特异性较高 2、价格较低，适合于对大量样品的筛查 不足：各家ELISA试剂盒采用的抗原和工艺不同，使测 定的敏感性和特异性产生较大的差异，临床实验 室在选用ELISA试剂前应认真进行评估,梅毒的血清学试验（五）,梅毒螺旋体快速诊断试验（TP-RT） 原理：双抗原夹心免疫层析试验或间接法免疫渗滤试验， 多采用胶体金进行标记，同时检测IgG、IgM抗体 （双抗原夹心法）或单测IgG抗体（间接法） 优点：1、简便、快速，不需要特殊的仪器 2、适合于单人份操作，可用于较紧急的场合 不足：1、临床评估资料不多，敏感性、特异性尚有待进 一步考查 2、无法实现自动化，结果判断主观 3、测定结果受温度和时间的影响较大 4、未通过国家的批批检,梅毒的血清学试验（六）,梅毒免疫层析快速检测方法,,结果及意义 ━━━━━━━━━━━━━━━━━━ 非特异 特异性 意义 RPR TP ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━ － 　　　 － 　 排除梅毒 　＋　　　　－　　非特异感染，如麻风,SLE ＋ 　　　 ＋　 梅毒感染 　－　　　　＋ 　 梅毒经治疗后 ━━━━━━━━━━━━━━━━━━,梅毒抗体检测的临床意义,1.TRUST适用于筛查和治疗效果的监测，梅毒螺旋体抗原试验(ELISA、TPPA、金标记免疫层析等)，对潜伏期和晚期梅毒敏感性更高。 2.梅毒的血清学试验阳性，只提示所测标本中有抗类脂抗体或抗TP抗体存在，不能作为患者感染梅毒的绝对依据，阴性结果也不能排除梅毒螺旋体感染，检测结果应结合临床综合分析。 3.最好每次用两种以上方法检测。,关于梅毒血清学试验程序的探讨,梅毒螺旋体抗原血清试验（TPPA等）,Thank you!!,