病原学、免疫学及生化检测.ppt

病原学、免疫学及生化检测,,微生物是存在于自然界中的一群体形细小、结构简单、肉眼直接看不见、必须借助光学显微镜或电子显微镜放大几百倍、几千倍甚至几万倍才能观察到的微小生物。,,使用油镜时，需在玻片上滴加香柏油。这是因为油镜的放大倍数较高，而透镜很小，光线通过不同密度的介质物体（玻片→空气→透镜）时，部分光线会发生折射而散失，进入镜筒的光线少，视野较暗，物体观察不清。如在透镜与玻片之间滴加和玻璃折射率（n=1.52）相仿的香柏油（n=1.515），则使进入油镜的光线增多，视野亮度增强，物象清晰。,一、微生物分类,微生物虽然个体微小，但具有一定的形态结构和生理功能，所以按其结构和组成的差异分为三大类 1、非细胞型微生物：体积微小，能通过滤菌器，只能在活细胞内生长繁殖，如病毒、噬菌体； 2、原核细胞型微生物：仅有原始核，无核仁和核膜，缺乏完整的细胞器，如细菌、放线菌、支原体、衣原体； 3、真核细胞型微生物：细胞核的分化程度较高，有核膜、核仁和染色体，胞质内有完整的细胞器，如霉菌、酵母菌、藻类等。,二、细菌生长繁殖的条件,1、充足的营养。水、碳源、氮源、无机盐和生长因子。 2、合适的酸碱度。大多数为中性或弱碱性，即PH7.2-7.6。个别细菌在较碱性的培养基中生长良好。 3、适宜的温度。分为嗜冷菌、嗜热菌、嗜温菌。 4、必要的气体环境。主要是氧与二氧化碳。,三、细菌群体的生长繁殖分期,1、迟缓期。此期中细菌体积增大，代谢活跃但不分裂，菌数并不增多。此期长短不一，从数小时到数天不等，视菌种、菌龄与接种菌量和营养物质的不同而异。 2、对数生长或指数期。此期中细菌生长迅速，以恒定的速度进行分裂繁殖，菌数以几何级数增长，增长极快。研究细菌的性状最好选用此期的细菌。 3、稳定期。对数期后，细菌繁殖速度逐渐下降，细菌繁殖数与死亡数几近相等，活菌数保持稳定。 4、衰亡期。活菌数急剧减少。,,四、细菌的染色,1、分为单染法、复染法、特殊染色法、负染色法、荧光染色体法等。 单染法：只用一种染液，可显示细菌的形态与排列，不能显示细菌的结构与染色反应的特性。 原理：由于细菌在中性环境中一般带负电荷，所以通常采用碱性染料如美蓝、碱性复红、结晶紫、孔雀绿、番红等进行染色。这类染料解离后，染料离子带正电荷，使细菌着色。,,复染法：用两种以上不同颜色的染料进行染色，除可观察细菌的形态、排列、大小外，还能将细菌染成不同的颜色。 常用的革兰氏染色法和抗酸染色法即为复染法。,,2、革兰氏染色法 2.1原理：依据的是细菌的细胞壁组成成分和结构的不同，革兰氏阳性菌的细胞壁肽聚糖层厚，交联而成的肽聚糖网状结构致密，经乙醇处理发生脱水作用，使孔径缩小，通透性降低，结晶紫与碘形成大分子复合物保留在细胞内而不被脱色，结果使细胞呈现紫色。而革兰氏阴性菌肽聚糖层薄，网状结构交联少，而且类脂含量较高，经乙醇处理后，类脂被溶解，细胞壁孔径变大，通透性增加，结晶紫与碘的复合物被溶出细胞壁，因而细胞被染色，再经番红复染后细胞呈红色。,,2.2试剂： 2.2.1碱性染料 草酸铵结晶紫液； 2.2.2媒染剂 碘液，其作用是增强染料与菌体的亲和力，加强染料与细胞的结合； 2.2.3脱色剂 乙醇，将染料溶解，使被染色的细胞脱色。利用不同细菌对染料脱色的难易程度不同，而加以区分； 2.2.4复染液 番红溶液，目的是使经脱色的细菌重新染上另一种颜色，以便与未脱色菌进行比较。,,2.3操作过程 标本经固定后，先用结晶紫染色、再加碘液媒染、然后用乙醇脱色，最后用沙黄或复红复染。 2.4意义 依据革兰氏染色可将细菌分为阳性和阴性两大类。由于阳性、阴性细胞壁等结构上的差别可造成对抗生素的敏感性不同，临床上依据此，可选择性针对用药。,,1.涂片固定,2.单染—结晶紫染液第一次染色 1min,,,3.媒染—碘-碘化钾溶液浸湿30S,4. 脱色—95%乙醇溶液进行颜色洗脱,5.复染—红色的藩红染液第二次染色,,,2.5注意事项 2.5.1制片是染色的关键，载片要清洁，不得沾污油脂，菌株才能涂布均匀。注意初次涂片时，取菌量不应过大，以免造成菌体重叠。 2.5.2注意水流不得直接冲在涂菌处，以免将菌体冲掉。 2.5.3脱色是革兰氏染色的关键，必须掌握乙醇的脱色程度。若脱色过度则阳性菌被误染为阴性菌，而脱色不够时阴性菌被误染为阳性菌。（拉丝试验——未断裂DNA螺旋）,,革兰氏染色1884年丹麦医师Gram所发明,紫色者为G＋菌，红色者为G—菌,细菌呈现第一次染色的效果紫色，革兰氏阳性菌（紫阳G＋）；,呈现第二次染色的效果红色；称革兰氏阴性菌（红阴G -）,,五、细菌的培养和分离,大多数细菌可以用人工方法培养，但必须根据不同细菌采取各自适宜的条件，如无菌技术、接种和分离方法、培养基和培养条件等 1、样品处理 标本采集是否符合要求，直接影响细菌的检测结果，因此要求除粪、痰、咽拭子等标本，其他样本均应以无菌技术采集。 标本盛于无菌容器内，根据目的菌的种类采用不同的方法采集，标本采集后及时冷藏送检。,,2、无菌技术 2.1细菌学检验必须随时防止污染和病原菌的扩散，为达到此目的而采取的技术就是无菌技术或无菌操作，在进行细菌培养检查过程中，无论是标本采集或培养操作，均需严格执行无菌操作技术。 2.2所用器具、培养基等必须严格灭菌，使用过程中不得与未经消毒物品接触，忌长时间暴露于空气手中，有盖的应迅速盖上。 2.3灭菌的试管、玻璃等在打开盖后及关闭前，口部应在火焰上通过1-2次，以杀灭可能从空气中落入的杂菌；接种环或接种针每次使用前后，均应在火焰上烧灼灭菌，金属棒或玻璃棒部分亦须转动通过火焰3次。,,2.4进行细菌检验的全过程应在无菌室、接种罩或生物安全柜内进行。 2.5检验时忌用手接触标本及已灭菌的器材内部，也勿用口吹以防其他杂菌混入培养物中。 2.6打开瓶塞及试管塞时，应将塞子上端夹持于手指间适当位置，不得将棉塞任意放置别处。,,3、接种、分离及结果观察 接种细菌应用接种环（针）来蘸取细菌标本，进行接种，其程序可分为：灭菌接种环 冷却 蘸取细菌标本 进行接种 接种环灭菌5个程序。,,,,,,细菌的接种与分离技术 平板分区划线法 每划完一区，要将接种环灭菌 2 斜面接种法--常用于双糖管接种 3 液体接种法--糖类微量生化管 4 穿刺法 -----常用于半固体接种 5 倾注平板法--自来水细菌计数 6 涂布接种法--纸片法药敏试验,,,,,六、生化反应,1、各种细菌具有各自独特的酶系统，因而在代谢过程中所产生的分解和合成的代谢产物也不同，这些分解或合成代谢产物又各有不同的生化特点，利用此生化特点来检查代谢产物以鉴别细菌的方法，称为生化反应。 2、生化反应主要分为糖类的代谢试验、蛋白质和氨基酸的代谢试验、有机酸盐和铵盐的利用试验、呼吸酶类试验及其他酶类试验。,,,2.1碳水化合物的代谢试验,糖、醇、苷发酵试验,糖,细菌→,生长分解糖,,,,,产酸PH↓,,,不同微生物分解利用糖类的能力有很大差异，或能利用或不能利用，能利用者，或产气或不产气。可用指示剂及发酵管检验。,淀粉水解试验,某些细菌可以产生分解淀粉的酶，把淀粉水解为麦芽糖或葡萄糖。淀粉水解后，遇碘不再变蓝色。,O/F（葡萄糖）试验,细菌分解葡萄糖时利用分子氧—氧化型(O) 无氧降解—发酵型(F) 不分解葡萄糖—产碱型(-) 一管加石腊油,ONPG试验,阳性-黄色,阴性对照-无色,本试验可同时观察乳糖和蔗糖发酵产酸或产酸产气（变黄）；产生硫化氢（变黑）。葡萄糖被分解产酸可使斜面先变黄，但因量少，生成的少量酸，因接触空气而氧化，加之细菌利用培养基中含氮物质，生成碱性产物，故使斜面后来又变红，底部由于是在厌氧状态下，酸类不被氧化，所以仍保持黄色。,1.下黄上不黄 为分解 葡萄糖，不分解乳糖 2.上下均黄 为分解 葡萄糖、乳糖 3.上下均不黄 为非发 酵菌 4.中间变为黑色为产 H2S,,,,沙门氏菌的TSI试验,VP、MR试验,葡萄糖,丙酮酸,乙酰甲醇→二乙酰＋胍基→红色 VP阳性 肺炎克雷伯菌,甲酸、乙酸PH↓＋甲基红试剂→红色 MR阳性 大肠埃希菌,,,,,VP,MR,阳,阴,阳,对,,,V-P试验,某些细菌在葡萄糖蛋白胨水培养基中能分解葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸缩合，脱羧成乙酰甲基甲醇，后者在强碱环境下，被空气中氧氧化为二乙酰，二乙酰与蛋白胨中的胍基生成红色化合物，称V－P（+）反应。,,,甲基红（Methyl Red）试验,肠杆菌科各菌属都能发酵葡萄糖，在分解葡萄糖过程中产生丙酮酸，进一步分解中，由于糖代谢的途径不同，可产生乳酸，琥珀酸、醋酸和甲酸等大量酸性产物，可使培养基PH值下降至pH4.5以下，使甲基红指示剂变红。,2.2蛋白质和氨基酸代谢试验,★吲哚试验,,,,,,靛基质（Imdole）试验,某些细菌能分解蛋白胨中的色氨酸，生成吲哚。吲哚的存在可用显色反应表现出来。吲哚与对二甲基氨基苯醛结合，形成玫瑰吲哚，为红色化合物。,★尿素试验,＋细菌→NH3、PH↑→红色 尿素阳性,尿素,,尿素酶（Urease）试验,有些细菌能产生尿素酶，将尿素分解、产生2个分子的氨，使培养基变为碱性，酚红呈粉红色。,1、未接种 2、尿素酶阳性 3、尿素酶阴性,★苯丙氨酸脱氨酶试验,苯丙氨酸＋细菌→苯丙酮酸＋FeCI3→绿色,★氨基酸脱羧酶试验,葡萄糖 溴甲酚紫对照管,,,,2.3碳源和氮源利用试验,★枸橼酸盐试验 细菌＋柠檬酸三钠→Na2CO3PH↑→深蓝色,,,枸椽酸盐试验,某些细菌能利用枸椽酸盐作为碳源，及磷酸铵作为氮源，将枸椽酸盐分解为二氧化碳，培养基反应后成碱性，由于指示剂的作用，培养基变为兰色。,★硝酸盐还原试验,细菌　＋　NO3－---------- NO2 　　 NO2＋对氨基苯磺酸（甲液）→对重氮基苯磺酸  　　对重氮基苯磺酸＋α-萘胺（乙液）→红色（＋） NO3－＋细菌＋甲、乙液→无色（-）＋锌粉（还原剂） 红色为阴性 无色为阳性 NO3－＋细菌→NO2→N2↑＋NH3↑,2.4酶类试验,细菌＋血浆 结合凝固酶 纤维蛋白→肉眼可见凝集 细菌＋血浆 游离凝固酶＋纤维蛋白→血浆凝固,,,★CAMP试验 B群链球菌产生CAMP因子，促进金葡溶血更好,★凝固酶试验,,七、血清学试验,1、基本概念 1.1血清学试验是利用抗原抗体在适宜条件下的体外特异反应，可作为抗原抗体的检测。 1.2抗原：是一种刺激机体引起免疫反应，产生抗体和（或）致敏淋巴细胞，并能在体外与其相应的抗体（或）致敏淋巴细胞发生特异性结合反应的物质。具有免疫原性和反映原性。 1.3抗体：是机体在抗原物质刺激下所形成的一类具有与相应抗原发生特异性结合反应的有特定结构的球蛋白。,,2、基本特性 高度特异性:此类反应是由于抗原决定族与抗体结合部位之间的物理化学特性相对应而相互结合的，故有特异性。 高度敏感性：检测限可达到纳克级甚至皮克级，其中以放免测定的敏感性最高，较差的是凝集反应和各种沉淀反应。 合适比例：当抗原抗体的量比例合适时出现明显的反应，且反应速度快，不合适的比例即不出现反应，属于抑制带。,,可逆性：抗原与抗体的结合是分子表面的结合，是非共价键的结合，这样结合虽相当牢固，但在一定条件下两者可以解离，如在复合物中加入酸、碱、过高的温度等。 反应过程的二阶段性：第一阶段为抗原抗体的特异性结合，需时很短，但无可见现象。第二阶段形成可见反应，需时较长，从数分钟到数小时不等。,,3、影响因素 温度：合适的温度可加快反应，特别是第二阶段受温度影响较大，一般以15-40摄氏度为宜，37摄氏度最适宜。 电解质：抗原抗体结合可不需要电解质，但复合物的相互凝集出现可见反应则需要电解质的存在。 PH：可影响反应的电离和点和性质，血清反应最适宜为6-8. 振摇和搅拌：可加速反应物的相互碰撞和接触，从而增快形成可见反应的速度。,,4、反应基本类型 4.1凝结反应 4.1.1细菌等颗粒性抗原加入相应抗体在适量电解质存在下，发生特异性反应，形成肉眼可见的凝集小块。可分为直接和间接两大类。 4.1.2直接凝集反应：指颗粒抗原直接与相应抗体结合而出现肉眼可见的凝集小块，具体有玻片法和试管法。 玻片凝集反应为定性反应，常用于细菌的鉴定与分型。 4.1.3间接凝集反应：是将可溶性抗原或抗体吸附于一种与免疫无关的一定大小的微粒上，使成致敏微球，然后与相应的抗体或抗原作用所发生的凝集。 微球应用最多的是人O型红细胞及羊红细胞。,,4.2沉淀反应 可溶性抗原与相应抗体结合，在有电解质存在的条件下，形成可见的沉淀物。 其反应机制与凝集反应基本相同，不同点是凝集反应的抗原是比较大的颗粒性物质、分子大，沉淀反应是比较小的可溶性物质、分子小；凝集反应的凝集块主要由抗原物质形成，沉淀反应的沉淀物主要是由抗体蛋白形成。 沉淀反应的试验方法有环状法、絮状法和琼脂扩散法三种基本类型。,,4.3补体结合反应 在补体参与下。以绵羊红细胞和溶血素为指标系统的抗原抗体反应。 4.4免疫标记技术 用荧光色素、酶或放射性同位素对抗体或抗原进行标记，并使其标记后不影响抗体或抗原活性，以此标记物进行抗原抗体反应，并通过对标记物的检测来判定结果。 常用的有免疫荧光法、免疫酶技术和同位素标记等类型。 免疫酶测定试验包括间接法、双抗体夹心法和竞争法。,谢谢大家！,