1、CELL CYCLE,第十三章 细胞周期,细胞增殖是生命的基本特征。初生婴儿1012个细胞,成人1014个,约200种类型。成人每秒钟有数百万新细胞产生。一个大肠杆菌若按20分钟分裂一次,并保持这一速度,则两天即可超过地球的重量。,第一节 基本概念,MAJOR CONCEPTS,一、什么是细胞周期,细胞分裂结束到下一次细胞分裂结束所经历的过程。分为:G1期(gap1),分裂完成到DNA复制之前。S期(synthesis phase),DNA复制阶段。G2期(gap2),DNA复制完成到分裂之前。M期,又称D期,分裂开始到结束。,Eucaryotic Cell Cycle,A typical m
2、ammalian cell has a cell cycle time of 24 hours, with 12 hr G1, 6-8 hr S, 3-4 hr G2, and 1 hr M,根据细胞周期可将高等动物细胞分为3类:连续分裂细胞,如表皮生发层、骨髓干细胞。休眠细胞,暂不分裂,适当刺激下可重新进入细胞周期,称G0期细胞,如淋巴细胞、肝、肾细胞等。不分裂细胞,又称终端细胞,不再分裂,如神经、肌肉、多形核细胞等。,二、细胞周期时间的测定,G1期差异较大,M期最短,约0.54.5小时。周期长短与物种/细胞类型有关。测定方法:标记有丝分裂百分率法(PLM),用3H TDR对测定细胞脉冲标记
3、、定时取材,通过统计标记有丝分裂细胞百分数来测定细胞周期。,T,PLM,常以(TG2+1/2TM)-TG2的方式求出TM,三、细胞同步化,(一)自然同步化1. 多核体:粘菌、疟原虫。2 . 水生动物受精卵:海胆、两栖类。3. 增殖抑制解除后的同步分裂:真菌休眠孢子。,(二)人工同步化,1. 选择同步化1)有丝分裂选择法优点:操作简单,同步化程度高,细胞不受药物伤害。缺点:获得的细胞数量较少(分裂细胞约占1%2%) 。2)细胞沉降分离法优点:可用于任何悬浮培养的细胞。缺点:同步化程度较低。,2. 诱导同步化1)DNA合成阻断法:用DNA合成抑制剂,可逆阻断细胞周期,然后释放。常用TDR双阻断法。
4、优点:同步化程度高;缺点:产生非均衡生长,个别细胞体积增大。2)中期阻断法用秋水仙素等微管抑制剂将细胞阻断在中期。优点是便于观察染色体,缺点是可逆性较差。,第二节 有丝分裂,MITOSIS,一、细胞分裂的类型,无丝分裂:又称直接分裂,由Remark(1841)发现于鸡胚血细胞,不涉及纺锤体形成及染色体变化 。有丝分裂:又称间接分裂,由Fleming (1882)和Strasburger(1880)发现。减数分裂:DNA复制1次,细胞连续分裂2次。,二、有丝分裂过程,为了便于描述人为的划分为六个时期:间期(interphase);前期(prophase);前中期(premetaphase);中期
5、(metaphase);后期(anaphase);末期(telophase)。间期包括G1期、S期和G2期,进行DNA、中心体复制,细胞体积增大等准备工作。,(一)前期染色质凝缩,分裂极确立与纺锤体开始形成,核仁解体,核膜消失。,S期中心粒已完成复制,核膜解体时,中心粒已到达两极,并形成纺锤体。纺锤体的三种微管结构:极体微管(polar mt);着丝点微管(kinetochore mt;星体微管(astral mt)。,Two centrosomes, and their forming radial arrays of astral microtubules separating on th
6、e surface of an early prophase newt lung cell nucleus.,图片来自http:/www.wadsworth.org/,图片来自http:/www.wadsworth.org/,(二)前中期从核膜解体到染色体排列到赤道面上。,(三)中期染色体排列到赤道面上。,(四)后期指妹妹染色体单体分开并移向两极的时期。分为后期A、后期B两个过程。,Anaphase A: separation of the sister chromatids.,Anaphase B: separation of the poles.,植物细胞有没有后期B ?,Microtub
7、ules and Motors in the spindle,(五)末期从子染色体到达两极,至形成两个新细胞为止的时期。涉及子核的形成和胞质分裂两个方面。,末期核纤肽B去磷酸化,介导核膜重新装配,同时染色体解聚缩,核仁出现和核膜重新形成。核分裂与胞质分裂是相继发生的,属于两个分离的过程,如:大多数昆虫的卵,核可进行多次分裂而无胞质分裂,某些藻类的多核细胞可长达数尺,以后胞质才分裂形成单核细胞。,子核的形成与胞质分裂,动物的胞质分裂通过胞质收缩环的收缩实现,收缩环由平行排列的肌动蛋白组成。,用细胞松弛素处理这一时期的细胞,会出现什么现象?,Dividing Muscle Myoblast (pr
8、imitive muscle cell) (SEM x8,000),植物细胞末期近两极处纺锤丝消失,中间微管保留,形成成膜体。来自高尔基体囊泡沿微管转运到成膜体中间。融合形成细胞板,囊泡的内含物形成初生壁和中胶层,囊泡膜形成质膜,融合留下的管道形成胞间连丝。,第三节 减数分裂Meiosis,由连续两次分裂构成:通常减数分裂I分离的是同源染色体,所以称为异型分裂(heterotypic division)或减数分裂(reductional division)。减数分裂II分离的是姊妹染色体,类似于有丝分裂,所以称为同型分裂(homotypic division)或均等分裂(equational
9、division)。为了描述方便将减数分裂分为不同时期。,Meiosis,Concepts:Gametic meiosisSporic meiosisZygotic meiosis,一、间期,称前减数分裂间期或前减数分裂期(premeiosis),也分为G1、S和G2期。G2期是有丝分裂向减数分裂转化的关键时期。S期时间较长,部分DNA(约0.3%左右)是在合线期合成的。,二、分裂期,(一)减数分裂I1. 前期I通常分为5个时期:leptotene ,zygotene ,pachytene,diplotene,diakinesis。,2 . 中期I3 . 后期I:同源染色体随机分向两极,染色体
10、重组,人类染色体重组概率有223个。4 . 末期I5 . 减数分裂间期。 (二)减数分裂II可分为前、中、后、末四个四期,与有丝分裂相似。一个精母细胞形成4个精子;一个卵母细胞形成一个卵子及2-3个极体。,Chromosome recombination 1,Chromosome recombination 2,Minimum number of gamete types = 2n , In humans, n = 23,三、联会复合体,SC由两条同源染色体沿纵轴形成,外观呈梯子状。SC帮助交换的完成,SC上有重组节,是交换发生的部位。SC主要由碱性蛋白质和RNA组成,含有少量DNA。SC形成
11、合线期,成熟于粗线期,消失于双线期。在细线期/合线期加入DNA合成抑制剂,则抑制SC形成。,synaptonemal complex,第四节 细胞周期调控,CELL CYCLE CONTROL,一、研究背景,1970s Rao等发现与M期细胞(Hela)融合的间期细胞染色体发生凝缩,称为早熟凝集染色体。G1期PCC为单线状,因DNA未复制。S期PCC为粉末状,因DNA由多个部位开始复制。G2期PCC为双线染色体,说明DNA复制已完成。不同类的M期细胞也可诱导PCC产生,说明M期细胞具有促进间期细胞进行分裂的因子,即成熟促进因子( MPF)。,prematurely condensed chro
12、mosome,PCC,G1,S,G2,Hartwell 1960s, Nurse 1970s 分别以芽殖酵母和裂殖酵母为材料,利用温度敏感突变株,发现许多与细胞分裂有关的基因( cdc)。如:裂殖酵母cdc2、 芽殖酵母cdc28突变型在限制温度下无法分裂;wee1突变型则提早分裂,cdc25突变型细胞体积增大而不分裂;cdc2和cdc28都编码34KD的蛋白激酶,促进细胞周期进行,weel和cdc25分别表现为抑制和促进cdc2的活性。,FISSION YEAST,BUDDING YEAST,Cdc 25 & Wee1 mutant,T. Hunt 1980s发现海胆的卵裂过程中两种蛋白质的
13、含量随细胞周期振荡,命名为cyclin A和B,其mRNA能诱导蛙卵成熟。1988年Lohka将非洲爪蟾的MPF纯化。经鉴定MPF由32KD和45KD两种蛋白组成,是一种丝氨酸/苏氨酸激酶。进一步的研究发现MPF=cdc2+clyclin B,Leland H. Hartwell,R. Timothy (Tim) Hunt,Sir Paul M. Nurse,2001年10月8日美国人LelandHartwell、英国人Paul Nurse、TimothyHunt因对细胞周期调控机理的研究而获诺贝尔生理医学奖。,二、CDK,cdc2与细胞周期蛋白结合才具有激酶的活性,故名细胞周期蛋白依赖性激酶
14、(CDK)。cdc2又称CDK1,可将特定蛋白磷酸化,如:将核纤肽磷酸化导致核纤层解体、核膜消失;将H1磷酸化导致染色体的凝缩等。在动物中已知7种CDK。均含PSTAIRE保守序列,与周期蛋白的结合有关。,三、细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子,CKI对细胞周期起负调控作用,分为:Ink4: 抑制cdk4cyclin D1, cdk6cyclin D1。Kip:抑制大多数CDK。其中P21cip1还能与DNA聚合酶的辅助因子PCNA结合,直接抑制DNA的合成。,四、细胞周期蛋白cyclin,特点:在细胞周期中呈周期性变化。含有一段约100个氨基酸的保守序列,称为周期蛋白框,介导与CDK结合。作用:
15、激活和引导CDK作用于不同底物。已知30余种,分为4类:G1型、G1/S型、S型、M型。,不同类型的CDK/cyclin复合体,*包括D1-3,各亚型cyclin D在不同细胞中的表达量不同,但具有相同的功效。,G1期,在生长因子的刺激下,cyclin D表达,并与CDK4、CDK6结合,使下游的蛋白质如Rb磷酸化,释放转录因子E2F,促进许多基因的转录,如编码cyclinE、A和CDK1的基因。G1-S期,cyclinE与CDK2结合,激活DNA复制。G2-M期,cyclinA、cyclinB与CDK1结合,CDK1引起染色体凝缩、核膜解体等。,G1 CDK activate transcr
16、iption factor E2F,CELL CYCLE REGULATION,中期当MPF活性达到最高时,激活APC,通过泛素化途径降解cyclin B,完成细胞周期。分裂期周期蛋白N端具有降解盒。泛素由76个氨基酸组成,高度保守。共价结合泛素的蛋白能被蛋白酶体识别和降解,是细胞内短寿命蛋白和异常蛋白降解的普遍途径。,Destruction Box in Cyclins,26S蛋白酶体是大型的蛋白酶,可将泛素化的蛋白质分解成短肽。,M期CDK的激活起始于分裂期cyclin的积累。结合cyclin B的CDK1被Wee1将Thr14和Tyr15磷酸化而不具有活性,使CDK/cyclin不断积累
17、。在M期,Wee1的活性下降,cdc25使CDK去磷酸化,去除了CDK活化的障碍。CDK的激活需要Thr161的磷酸化,它是在CDK激酶(CDK activating kinase CAK)的作用下完成的。,五、M期CDK的激活,CDK ACTIVATING,六、细胞周期检验点(check point),组成:感受器、信号传导通路、效应器。主要检验点:G1/S检验点:DNA是否损伤?细胞外环境是否适宜?细胞体积是否足够大?在酵母中称start点,在哺乳动物中称R点(restriction point)。S期检验点:DNA复制是否完成?G2/M检验点:DNA是否损伤?细胞体积是否足够大?中-后期
18、检验点:纺锤体组装检验点。,FOUR CHECKPOINTS,ATM(ataxia telangiectasia-mutated gene)最早发现于毛细血管扩张性共济失调症患者,人类中大约有1%的人是ATM缺失的杂合子,表现出对电离辐射敏感和易患癌症。ATM编码一个蛋白激酶,结合在损伤的DNA上,其信号通路有两条。激活Chk1(checkpoint kinase), 使cdc25的Ser216磷酸化失去活性,抑制M-CDK的活性,中断细胞周期。激活Chk2,使P53被磷酸化而激活,然后P53作为转录因子,导致P21表达,P21抑制G1-S期CDK的活性,中断细胞周期。,七、生长因子对细胞增殖的影响,生长因子是与细胞增殖有关的信号物质,已知几十种,多数能促进细胞增殖。作用方式:旁分泌。信号通路:ras、cAMP、磷脂酰肌醇途径。如通过ras途径,激活MAPK,MAPK进入细胞核内,激活c-myc,myc作为转录因子促进cyclin D、SCF、E2F等G1-S有关的基因表达,细胞进入G1期。,See you!,