1、Bac-to-Bac 杆状病毒表达系统试剂盒内容物：Introduction：Overview：Bac-to-Bac 杆状病毒表达系统提供快速有效的方法产生重组杆状病毒。此方法基于让已经转入杆状病的质粒（杆粒）的位点特意转座子的表达框的质粒在 Ecoli 中扩增。Bac-to-Bac 杆状病毒表达系统主要包括：*pFastBac 捐献质粒的选择，它要能够产生包含目的位点的表达结构，这个目的基因的产生被杆状病毒特意位点启动子控制。*一个 Ecoli 宿主，DH10Bac，包含杆状病毒质粒（杆粒）和辅助质粒，在转染 pFastBac 表达结构后可以产生重组杆粒。*一个控制表达的质粒，包括 Gus
2、和/ 或 CAT 基因，以便在感染细胞后产生重组杆状病毒，表达 -葡萄糖酸酐酶和/或氯霉素乙酰转移酶。Bac-to-Bac 表达系统的优点：使用这个系统产生重组杆状病毒较传统的同源重组有以下优点：*与使用同源重组产生重组杆状病毒所需的 4-6 周相比，鉴别纯化重组病毒少于两周*减少了从斑点筛选重组病毒 DNA 所包含亲缘和非重组病毒的几率*可以快速同时进行大量重组，适合表达功能性研究的蛋白选择 pFastBac 菌体（Vector）：大量的 pFastBac 菌体都适于进行 Bac-to-Bac 表达系统。选择对于你的需要最合适的菌体。Vector 特点 参考pFastBacTM1 高水平表达
3、的强 AcMNPV聚乙烯（PH）启动子用于简单克隆的大量克隆位点Anderon 1996pFastBacTMHT 高水平表达的聚乙烯启动子；N-末端含有 6XHis，可以用来纯化重组蛋白，并可用Polayes 1996TEV 蛋白酶切去；提供 3 个阅读框pFastBacTMDual 两个强启动子（PH 和 p10）可以同时表达两种蛋白；两个大的克隆位点Harris 和 Polaye 1997指南用途：指南提供了一个对于 Bac-to-Bac 表达系统的概述，并对以下提供指导：1、 克隆目的基因到 pFastBacTM 供体质粒的选择2、 转化 pFastBacTM 结构到最高效的 DH10B
4、acTM 产生重组质粒3、 转染重组质粒 DNA 到昆虫细胞产生重组杆状病毒4、 扩增滴定（Amplify and titer）杆状病毒株，使用病毒株感染昆虫细胞表达目的重组蛋白重要的：Bac-to-Bac 杆状病毒表达系统是用来帮助你产生重组杆状病毒，在昆虫细胞中进行高水平表达目的基因的系统。虽然他可以帮助你很容易的产生杆状病毒表达你的重组蛋白，但是使用这系统更倾向于有杆状病毒生物学和昆虫表达背景的使用者。我们高度推荐使用者具有病毒和组织培养的技术和知识。Bac-to-Bac 表达系统表达系统的成分：表达系统简单高效的产生重组杆状不能给党。基于 Luckow1993 年的方法，此系统利用了位
5、点特意的专座子 Tn7 区简化和提高重组质粒 DNA*系统的第一个成分是用来克隆目的基因的 pFastBacTM 菌株。基于 pFastBacTM 菌株的选择，表达基因被 AcMNPV 的PH 或 p10 启动子控制，在昆虫细胞内高水平表达表达框被 Tn7 的左右臂包围，并且包含一个庆大霉素抗性点和SV40 多腺苷酸化信号，形成一个微型的 Tn7 *第二个主要结构是 Ecoli 的 DH10BacTM 品系，用来作为 pFastBacTM 菌株的宿主。DH10Bac TM 细胞包含带有微型 -attTn7 靶位点的病毒质粒和辅助质粒（详细见下文） 。一旦 pFastBacTM 表达质粒转入 D
6、H10Bac 细胞，转化就会发生在pFastBacTM 菌株的微型 Tn7 单位和微型-attTn7 的靶位点之间产生重组质粒。这个转化反应发生在辅助质粒提供的转化蛋白处。如果你已经完成了转化反应，你需要分离这个高分子量的重组质粒 DNA 并将质粒 DNA 转染如昆虫细胞趋产生重组杆状病毒，用来进行初步表达实验。在杆状病毒株扩增和滴定后，高效价的病毒株可以用来感染细胞，进行大规模的重组蛋白的表达。杆状病毒菌株：病毒菌株（杆粒） ，bMON14272(136KB)，在 DH10Bac Ecoli 中包括：*一个低拷贝的 微型 F 复制子*卡那霉素的抗性标记*一个来自于 pUC 载体的编码 Lac
7、Za 肽的 DNA 片段，用来接触病毒转座子，Tn7（微型 attTn7）已经被插入。插入的微型 attTn7 不会中断 LacZa 肽的阅读框。杆粒在具有卡那抗性的大的质粒 Ecoli DH10Bac 中扩增，在显色物质如 Bluo-gal 或 X-gal 和诱导剂 IPTG 存在时，能补充染色体 LacZ 的缺失形成蓝斑（ LacZ+）辅助质粒：DH10Bac Ecoli 也包含辅助质粒， pMON7124(13.2kb)，他编码转移酶和四环素抗性基因。这个辅助质粒提供 Tn7 转化功能。图示 Bac-toBac 系统：下图刻画了重组病毒的产生和目的基因的表达实验轮廓：流程：下图揭示了表达
8、目的基因的一般步骤1、 pFastBac donor 质粒（步骤：目的基因的克隆 ） 得到2、 pFastBac 重组体 （转化至 DN10Bac 细胞（含有杆粒和 helper） ） 得到3、 含有重组杆粒的 Ecoli 细胞 （重新划线） 得到4、 验证过的含有重组杆粒的 Ecoli 细胞 （过夜培养，分离重组杆粒 DNA） 得到5、 重组杆粒 DNA （使用 Cellfectin 试剂感染细胞） 得到6、 P1 重组杆状病毒株（10 6pfu/ml） （感染昆虫细胞扩增病毒） 得到7、 P2 重组杆状病毒株（10 7pfu/ml） （滴定感染昆虫细胞） 得到8、 蛋白的表达培养昆虫细胞：
9、一般指导：介绍：对于您的杆状病毒转移菌，我们推荐使用 Sf9 和 Sf21 昆虫细胞作为宿主。在开始你的转化试验和表达之前，确定你有收获的 Sf9 和 Sf21，并将其冻存。使用无血清的介质：昆虫细胞可能在无血清的条件下收获。我们推荐使用 Sf900 SFM。Sf900 SFM 对于维持 Sf9 和 Sf21 以及对于大规模生产重组蛋白，都是无蛋白的最优的介质。昆虫细胞培养参考指导：维持和传代昆虫细胞在贴壁和悬浮条件下冷冻细胞使用无血清的介质按比例增加细胞产量一般指导：昆虫细胞对于环境很敏感，此外化学和营养因素，物理因素都可以影响昆虫细胞的成长。需要优化以得到最大产量。考虑以下培养条件：*温度
10、：细胞的感染和成长的最适合范围是 27-28 度*PH：对于许多培养系统 6.1-6.4 时合适的范围。Sf900 SFM 在此范围内支持一般的空气和开盖培养*同渗重摩：鳞翅类细胞使用介质的最优同渗重摩是 345-380 mOsm/kg*通风：对于最优生长条件和蛋白的表达，昆虫细胞要求被动的通氧。积极的通氧系统要求溶氧饱和在 10%-50%*剪切力：悬浮培养产生机械剪切力。生长的昆虫细胞在含有血清的介质中（10%-20% FBS） ，对于细胞的剪切力一般会得到足够的保护。如果你的细胞在无血清条件下生长，加入剪切力保护剂例如 PluronicF-68。注意：在 Sf900 SFM 中生长的细胞不
11、需要加入剪切力保护剂。转染的细胞：你需要的是对数期的细胞95%发育能力，可以完成成功的转染。产生重组的 pFastBacTM 菌株（Vector）一般信息：介绍：为了产生包含目的基因的重组质粒，使用 Bac-to-Bac 杆状病毒表达系统，你需要使用限制酶消化和连接，将你的目的基因克隆进入 pFastBac 菌的其中一种。一般分子生物学技术：为了帮助限制酶消化和连接 DNA 的序列，需要其他一般的分子生物学技术扩增和保存质粒：pFastBac 菌种和他的相应的表达对照质粒包含氨苄青霉素抗性基因，可以使用 Ecoli 进行 Amp 筛选。为了扩增和保存 pFastBac 和 pFastBac 对
12、照质粒，使用以下方法：1、 使用载体株系感染一个 recA ,endA Ecoli 株，例如 Top10，DH10B 或者 DH52、 在含有 100ug/ml Amp 的 LB 琼脂糖平板选择转化株。3、 选择含有质粒的转化子制备甘油菌以便长期保存克隆进入 pFastBacTM1介绍：为了帮助你设计策略克隆你的目的基因进入 pFastBacTM1，参考以下建议和表格克隆考虑事项：pFastBac TM1 菌株是非融合菌株（无融合标签） 。为了保证重组蛋白的表达，你的插入必须含有：*一个 ATG 起始密码子用于转录起始*一个终止密码子。注意：终止密码子包含在所有三个阅读框中的多克隆位点中注意：
13、重组蛋白的产生要求你的插入包含一个转录起始 ATG。一般来说，转移载体包含完整的 PH 引导序列，可以提高表达的产量。蛋白翻译能够起始于多克隆位点上游突变的 ATG（ATT） ，尽管如此，从这个位点起始的效率是低的，而且一般不干涉表达和重组蛋白的检测。pFastBacTM1 的多克隆位点：下图是 pFastBacTM1 的多克隆位点。限制位点标出来以便显示实际切刻位点。潜在的终止密码子下划线表示。pFastBac TM1 的全序列可以从网站下载。pFastBac TM1 的图谱和描述见后缀克隆进入 pFastBacTMHT A，B，C 介绍：pFastBac TMHT 载体由三个读码框（A ，
14、B ，C）提供的多克隆位点从而实现克隆目的基因，并且在 N 端带有6XHis。克隆：pFastBac TMHT 菌株是融合菌株。为了保证表达重组蛋白，你必须：*克隆你的基因要带有 ATG，位于 4050-4052 碱基对间。这个将会产生融合表达，带有 6XHis 标签，可以用 TEV 切除*你的插入要含有终止密码注意：重组蛋白的产生要求你的插入包含一个转录起始 ATG。一般来说，转移载体包含完整的 PH 引导序列，可以提高表达的产量。蛋白翻译能够起始于多克隆位点上游突变的 ATG（ATT） ，尽管如此，从这个位点起始的效率是低的，而且一般不干涉表达和重组蛋白的检测pFastBacTMHT A
15、的多克隆位点：下图是 pFastBacTMHT A 的多克隆位点。其实 ATG 用黑体标出。限制性位点标出来以便显示实际切刻位点。pFastBacTMHT B 的多克隆位点：下图是 pFastBacTMHT A 的多克隆位点。其实 ATG 用黑体标出。限制性位点标出来以便显示实际切刻位点。框住的核苷酸显示出的是易变区域。pFastBacTMHT C 的多克隆位点：下图是 pFastBacTMHT A 的多克隆位点。其实 ATG 用黑体标出。限制性位点标出来以便显示实际切刻位点。框住的核苷酸显示出的是易变区域。注意 pFastBacTMHT C 在 Xba 位点内有一个终止密码子，他在 N 端标
16、签框内。确定你的基因的 5端是在 Xba 位点上游开始。克隆进入 pFastBacTMDual介绍：pFastBac TMDual 包含两个多克隆位点，可以同时表达两个异源基因，一个通过 PH 启动子控制，另一个通过P10 启动子控制。参见下列建议以便有助于你的基因克隆克隆事项：pFastBac TMDual 是一个非融合载体。为了保证重组蛋白的表达，你的插入必须含有以下两点*一个 ATG 起始密码子*如果你不使用多克隆位点中的终止密码子，就必须要有一个终止密码子注意：重组蛋白的产生要求你的插入包含一个转录起始 ATG。一般来说，转移载体包含完整的 PH 引导序列，可以提高表达的产量。对于插入
17、克隆上游的聚乙烯启动子，注意到蛋白翻译能够起始于多克隆位点上游突变的 ATG（ATT） ，尽管如此，从这个位点起始的效率是低的，而且一般不干涉表达和重组蛋白的检测。PH 启动子下游的多克隆位点：下图是 pFastBacTMDual 中 PH 启动子下游的多克隆位点的图示。限制性位点标记出来显示了实际的切刻位点。潜在的终止密码子有下划线标出。P10 启动子下游的多克隆位点：下图是 pFastBacTMDual 的 AcMNPV p10 启动子下游的多克隆位点。限制性位点标记出来以便显示实际切刻位点。潜在的终止密码子标记下划线。转化和分析介绍：如果你已经完成了你的连接反应，你就要准备把你的 pFa
18、stBacTM 结构转化进 Ecoli 了。很多 Ecoli 宿主菌和转化程序都是可以使用的。一般推荐转化 Ecoli 和分析转化在下面列出Ecoli 宿主：一旦你把你的插入序列克隆进入了 pFastBacTM，你需要转化连接反应到 Ecoli，并选择优 Amp 抗性的转化株。你可以使用任何 recA，end A Ecoli 菌。包括 Top10，DH10B 或者 DH5 进行转化。不要转化连接反应进入DH10Bac 细胞。 注意 TOP10 和 DH10B 感受态细胞可以从 Invitrogen 得到转化方法：你可以选择使用任何方法对 Ecoli 进行转化。化学转化是最便利的方法，而电转对大
19、质粒是最有效的方法。选择好转化株，使用含有 100ug/ml Amp 的 LB 平板。转化株分析：一旦你得到 Amp 抗性转化株，我们有以下推荐：1、 选出 10 个转化株，在含有 100ug/ml 的 Amp 的 LB 或 S.O.B 培养基过夜培养2、 使用你选的方法分离质粒 DNA。我们推荐使用公司的试剂盒3、 使用限制性方法分析质粒，证明是重组质粒并证明插入起始的正确。使用限制性酶或者酶化合物对 Vector 和插入端各进行一次酶切。使用 PCR 对转化株进行分析：你也可以使用 PCR 方法对阳性转化株进行分析。使用合适的 PCR 引物和 Amp 条件。如果你是第一次使用此方法，你最好
20、使用限制性分析作平行试验。使用错误的引物或污染的平板可能会得到假象。以下方法可以给你提供便利。其他方法也是可用的。需要的材料：高保真 PCRSuperMix，合时的 PCR 前后引物过程：1、对于每个样品，在 0.5ml 的小离心管加入 48ul 的高保真 PCR SuperMix 和各 1ul 的前后引物。2、选出 10 个克隆，在上述离心管中进行重悬（记得做一个 Patch 板保护克隆以便进行更深的分析）3、94 度 10 分钟溶解细胞灭活核酸酶4、20-30 个循环进行扩增5、延伸使用 72 度 10 分钟。4 度储存6、琼脂糖凝胶电泳检测测序：对于你的结构需要进行测序证明目的基因是正确
21、的起始以便表达。如果你是将基因克隆进入了pFastBacTMHT，证明的基因进入了 N 末端标签的读框中。长期保存：一旦你证明了测序的正确，确定克隆的纯度并制作甘油菌长期保存。推荐储存质粒 DNA 在-20 度1、 在含有 100ug/ml 的 LB 平板上对原始的克隆进行划线培养2、 挑单克隆在 1-2ml 含有 Amp 的 LB 抚育3、 培养至稳定期4、 在 0.85ml 的培养物中混合 0.15ml 的过滤甘油，转到冷冻小管5、 -80 度储存重组质粒的产生转化到 DH10Bac Ecoli介绍：一旦你有了你的 pFastBacTM 结构，你就可以准备转化纯化的质粒 DNA 进入 DH
22、10BacTMEcoli，转变成为杆粒。你可以使用蓝/白斑选出含有重组杆粒的克隆。 Bac-toBac 表达系统提供高效 DH10BacTM 感受态细胞。阳性对照：每个 pFastBacTM 质粒都提供相应的阳性对照用来作为阳性转染和表达对照（下表） 。根据pFastBacTMVecctor 的使用，我们推荐在你的 DH10Bac 转染试验中作相应的对照。所需材料：开始之前你需要有以下材料*纯化的 pFastBacTM 结构（200pg/ul 储存于 PH8.0 的 TE）*阳性表达对照*高效 DH10BacTM 感受态细胞（表达系统提供，每个转化试验使用 1 管细胞）*pUC19（与 DH10Bac 一起提供，用来做对照）*LB 平板，包含 Kan，Gen（庆大） ，Tetracycline（四环素） ，Bluo-gal（卤代吲哚基-beta-D-半乳糖苷）和IPTG。（每个转化 3 个板，使用新鲜平板，推荐见下文） *LB 板含有 100ug/mlAmp（用于 pUC19 转化对照）
