1、酵母中含有丰富的蔗糖酶(EC.3.2.1.26),细胞膜内侧细胞质，含有少量的糖。,外蔗糖酶,内蔗糖酶,细胞膜的外侧，占蔗糖酶活力的大部分，是含有50% 糖成分的糖蛋白。,由于内酶含量很少，极难提取，本实验提取纯化的主要是外酶。,实验一 酵母蔗糖酶的提取与纯化,本实验以酵母为原料，通过破碎细胞、加热除杂蛋白、乙醇沉淀、离子交换柱层析等步骤，分离纯化酵母蔗糖酶，并用聚丙稀酰胺凝胶电泳对其纯度进行初步检验。,有机溶剂分级的原理：有机溶剂分级是利用不同蛋白质在不同浓度的有机溶剂中溶解度的差异分离酶蛋白的一种方法。其原理是：1、有机溶剂能降低溶液的介电常数，增加蛋白质分子上不同电荷的引力，使蛋白质溶解
2、度下降；2、有机溶剂与水作用，能破坏蛋白质的水化膜，使蛋白质的溶解度下降。,结合力的大小取决于彼此之间相反电荷基团的静电引力,静电引力大小与溶液的pH值有关，因pH值决定蛋白质的解离程度。,阳离子交换剂 样品溶液pHpI时，酶带正电荷；阴离子交换剂 样品溶液pHpI时，酶带负电荷一般样品溶液的pH与酶pI相差一个pH以上,样品溶液的pH与酶pI相差越大的，带电荷越多,通过逐渐增加洗脱液离子强度的梯度洗脱方式，可使结合在层析柱上的蛋白质按照结合力由小到大的顺序依次被洗出层析柱。,Sampleapplicationand wash,Elution,Equilibration,Regeneratio
3、n,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,本实验中使用的DEAE-52是弱碱性的阴离子纤维素，其基本骨架是纤维素、活性基团为二乙基氨乙基（DEAE）。该纤维素的吸附量大，分辨率高，化学性质稳定。,控制：样品溶液pHpI时，酶带负电荷,离子交换柱层析的原理：根据物质的酸碱度、极性和分子大小的差异，使其分离的技术在分离过程中，以离子交换剂作用为主导。在众多的交换剂中，离子交换纤维素的优点是：1、开放性的长链结构、较大的表面积，所以对蛋白质吸附容量大；2、纤维素上离子基团数量不多且排列疏散，对蛋白质的吸附不是太牢固，所以用缓和的洗脱条件即可达到分离目的，不致引起蛋白质变3、用其装好
4、的层析柱在较广的pH和盐浓度范围内都不会发生体积的改变，所以有利于蛋白质层析。本实验中使用的DEAE-52是弱碱性的阴离子纤维素，其基本骨架是纤维素、活性基团为二乙基氨乙基（DEAE）。该纤维素的吸附量大，分辨率高，化学性质稳定。,为了确定哪个峰是含目标酶，要进行酶活力的测定； 用蔗糖做底物反应一段时间后，检测生成的葡萄糖的量；用尿糖试纸初步检测；用DNS法精确检测。,Sucrase（蔗糖酶）,glucosefructose,Sucrose,Semi-quantitative assay of yeast sucrase activity with U-Glu test-tapeSucrose
5、 glucose oxidase（葡萄糖氧化酶 ） gluconic acidH2O2 （葡萄糖酸 ） H2O+O2- coloured substance,Sucrase（蔗糖酶）,glucosefructose,Hydrogen peroxidase（过氧化氢酶）,colourless substance（无色物质）,U-Glu test-tape尿糖试纸,DNS法精确检测,黄色的3,5-二硝基水杨酸（DNS）试剂与还原糖在碱性条件下共热后，自身被还原为棕红色的3-氨基-5-硝基水杨酸。在一定范围内，反应液里棕红色的深浅与还原糖的含量成正比而葡萄糖生成量又与待测液的酶活力大小成正比。,酶活
6、定义： 在37 ，Ph4.5，每分钟催化蔗糖生成1M葡萄糖的酶量为1个酶活力单位。,DNS法测葡萄糖浓度,附图：葡萄糖标准曲线,为了确定获得的目标酶纯不纯，要进行SDS-PAGE电泳检测；,二、实验步骤,1.破碎细胞 取5 g干酵母，加5 g石英砂，置于预先冷却的研钵中，加30 mL去离子水，研磨30 min，在冰箱中冰冻约10 min（研磨液面上刚出现冰结为宜），重复2次。将研磨液转移至大离心管中，12000 r/min离心15 min，弃去沉淀。留0.5 mL上清液为第一组分。,2.加热除杂蛋白 将上清液转入三角瓶，用1 mol/L醋酸溶液逐滴加入，调其pH值至5.0，然后迅速放入50的水
7、浴中，保温30 min。在温育过程中，注意经常缓慢搅拌液体。之后在冰浴中迅速冷却之，以12000 r/min的转速离心20 min，弃去沉淀。留0.5 mL上清液为第二组分。,3.乙醇沉淀 量出上清液的体积，加入等体积的95%冷乙醇溶液(预先放在-20低温下的时间不少于30 min)，于冰浴中温和搅拌20 min。然后以12000 r/min的转速离心25 min，小心弃去上清液，沉淀沥干。将沉淀溶解在6 mL 0.05 mol/L Tris-HCl缓冲液(pH值7.3)中，搅拌(5 min以上)使其完全溶解，以12000 r/min的转速离心25 min，取出0.5 mL上清液作为第三组分，
8、剩余部分(乙醇抽提液)进行第4步操作。,4.上柱 装DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换柱层析，用0.05 mol/L Tris-HCl缓冲液(pH值7.3)平衡。将乙醇抽提液上柱，上样后用0.05 mol/L Tris-HCl缓冲液(pH值7.3)平衡，然后用0.05 mol/L Tris-HCl缓冲液(内含0.5 mol/L NaCl溶液，pH值7.3)进行NaCl梯度(NaCl溶液浓度为0-0.5 mol/L)洗脱。,层析柱连上梯度混合器，混合器分别装30 mL 0.05 mol/L Tris-HCl缓冲液(pH值7.3)和30 mL含有0.5 mol/L NaCl的
9、0.05 mol/L Tris-HCl缓冲液(pH值7.3)，每1 min收集1管。洗脱至混合器中液体流完为止，测定各接收管在280 nm下的光吸收值，并用尿糖试纸半定量测定各管的酶活力。收集酶活力最高的1管酶液作为第四组分用于纯度测定。,5.用尿糖试纸进行半定量测定： 在白瓷板每孔中分别滴3滴待测酶液，再加3滴含10蔗糖的pH 4.5的醋酸缓冲液，搅匀，37放置10 min，浸入尿糖试纸，1 s后取出，60 s后比较颜色的深浅，与比色卡对照。,6. DNS法精确检测,试剂配制,葡萄糖标准液配制（1mg/ml）：预先将分析纯葡萄糖置80烘箱内约12小时。准确称取500mg葡萄糖于烧杯中，用蒸馏
10、水溶解后，移至500ml容量瓶中，定容，摇匀（冰箱中4保存期约一星期）。醋酸buffer(0.2mol/L)称取3.28g无水乙酸钠，溶解于150ml蒸馏水，用冰乙酸调节其ph至4.5，然后定溶至200mL。10%蔗糖溶液：10g蔗糖溶解于醋酸buffer(0.2mol/L)中，定容至100ml1mol/L NaoH溶液：4gNaoH溶解于100ml蒸馏水中,四、结果分析 以梯度洗脱出的管数为横坐标，以吸光度A280、酶活、NaCl浓度为纵坐标，绘出层析曲线和酶活曲线图。五 思考题：离子交换纤维素层析的优点有哪些？有机溶剂抽提蛋白质的原理是什么？,数据处理,Review Total activ
11、itySpecific activityhow to calculate it, what it means, how it changes during a purificationFold purificationwhat it is, how to calculate itYieldwhat it is, how to calculate it, how it changes during a purification,两重要概念,1：回收率是纯化后的总活力除以纯化前的总活力2： 纯化倍数是纯化后的比活力除以纯化前的比活力（第一次的比活力）注：比活力：比活力活力单位数mg蛋白,实验二 S
12、DS-PAGE电泳,一、实验步骤 1. 试剂配制,（1）丙烯酰胺和N, N-亚甲双丙烯酰胺。以温热（利于溶解双丙烯酰胺）的去离子水配制含有29%（w/v）丙烯酰胺和1%（w/v）N, N-亚甲双丙烯酰胺的贮存液 。,（2）1.5M Tris，pH8.8（分离胶缓冲液）：1.5M Tris-HCl，0.4% SDS（3）0.5M Tris，pH6.8（浓缩胶缓冲液）：0.5M Tris-HCl，0.4% SDS（4）10%过硫酸铵,以上先配！,等待凝胶聚合时再配！（8）Tris-甘氨酸电泳缓冲液(pH 8.3)：0.025M Tris，0.192M 甘氨酸，0.1% SDS（9）样品处理液：50
13、mM Tris-HCl(pH 6.8)，100mM DTT(or 5% 巯基乙醇)，2% SDS，0.1% 溴酚蓝，10%甘油,（10）染色液：0.1% 考马斯亮蓝 R250，40% 甲醇，10% 冰醋酸（11）脱色液：10% 甲醇，10% 冰醋酸,2. SDS聚丙烯酰胺凝胶的灌制,（1）根据厂家说明书安装玻璃板（2）确定所需凝胶溶液体积，按下表给出的数值在一小烧杯中按所需丙烯酰胺浓度配制一定体积的分离胶溶液。一旦加入TEMED，马上开始聚合，故应立即快速旋动混合物并进入下步操作。,（3）迅速在两玻璃板的间隙中灌注丙烯酰胺溶液,留出灌注浓缩胶所需空间(梳子的齿长再加0.5cm)。再在胶液面上小
14、心注入一层水（约23mm高），以阻止氧气进入凝胶溶液。（4）分离胶聚合完全后（约30分钟），倾出覆盖水层，再用滤纸吸净残留水。,（5）制备浓缩胶：按下表给出的数据，在另一小烧杯中制备一定体积及一定浓度的丙烯酰胺溶液，一旦加入TEMED，马上开始聚合，故应立即快速旋动混合物并进入下步操作。,（6）聚合的分离胶上直接灌注浓缩胶,立即在浓缩胶溶液中插入干净的梳子。小心避免混入气泡，再加入浓缩胶溶液以充满梳子之间的空隙，将凝胶垂直放置于室温下。（7）在等待浓缩胶聚合时，可对样品进行处理，在样品中按1:1体积比加入样品处理液，在100加热3分钟以使蛋白质变性。,（8）浓缩胶聚合完全后（30分钟），小心移
15、出梳子。把凝胶固定于电泳装置上，上下槽各加入Tris-甘氨酸电极缓冲液。必须设法排出凝胶底部两玻璃板之间的气泡。,3. 样品的处理,将100ul蛋白样品与100ul样品处理液混合均匀，然后将此混合液在100摄氏度中水浴10min，冷却至室温后，12000rpm离心10分钟，即做成电泳样品。,4.加样电泳,（1）按予定顺序加样，加样量通常为1025l（1.5mm厚的胶）。（2）将电泳装置与电源相接，凝胶上所加电压为8V/cm。当染料前沿进入分离胶后，把电压提高到15V/cm，继续电泳直至溴酚蓝到达分离胶底部上方约1cm，然后关闭电源。,（3）从电泳装置上卸下玻璃板，用刮勺撬开玻璃板。紧靠最左边一
16、孔（第一槽）凝胶下部切去一角以标注凝胶的方位。,5.染色 经SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离的蛋白质样品可用考马斯亮蓝R250染色。染色12小时或过夜。,6.脱色,需310小时，其间更换多次脱色液至背景清楚 脱色后，可将凝胶浸于水中，长期封装在塑料袋内而不降低染色强度。为永久性记录，可对凝胶进行拍照，或将凝胶干燥成胶片。此方法检测灵敏度为0.21.0g。,二.结果分析,观察并记录实验结果，判断酶的纯度，拍出电泳酶纯度的检验结果。,实验三 酵母蔗糖酶的结晶（蒸发和沉淀法相结合的悬滴蒸汽扩散结晶法）,一、原理 将含有一定盐浓度的缓冲液与含有低于这种盐浓度的蛋白质混合溶液在一个密封体系内一起蒸发扩散，最
17、后达到平衡，使蛋白质溶液内盐浓度提高，而pH值接近待结晶蛋白质等电点的缓冲液又使中性盐对蛋白质的盐析作用更为显著，因此导致蛋白质溶解度降低，溶液逐渐达到过饱和而析出结晶。,二、实验步骤,1.用“吹气法”除去酒精泡洗后的24孔组织培养板和盖玻片上可能带有的灰尘，以防形成不必要的成核中心而影响晶体的观察。,2.在24孔组织培养板的某孔中加入1 mL含0.2 mol/L NaCl的磷酸缓冲液（pH 6.5）作为池液,孔边缘均匀涂抹上高真空油脂，勿使其进入孔内。,3.吸取1 L待结晶酶蛋白溶液置盖玻片中央, 加等体积池液至此液滴中，用枪头轻轻地的吹吸液滴以保证混合液的均匀性并避免气泡出现。,4.小心、
18、迅速地翻转盖玻片并盖在培养板的孔上, 旋转45度以保证密封良好。5.室温下静置状态培养一周以上。,三、实验结果 一周后于体视镜下观察酵母蔗糖酶的晶体结构。,实验四 蔗糖酶酶学性质的研究,一、实验原理,酶学性质的研究包括：最适温度、最适pH、米氏常数、激活剂、抑制剂等。 一般通过单因素实验确定。,二、实验步骤,配如下溶液：0.2mol/L磷酸氢二钠 0.2mol/L乙酸钠 0.2mol/L柠檬酸 0.2mol/L乙酸 0.2mol/L磷酸二氢钠,1、最适pH的测定 （1）按下表配制缓冲溶液 将两种缓冲试剂混合后总体积均为10ml，其溶液pH值以酸度计测量值为准。,（2） 准备二组各7支试管，第一
19、组7支试管每支都加入0.2ml上表中相应的缓冲液，然后加入一定量的蔗糖酶。另一组7支试管也是每支都加入0.2ml上表中相应的缓冲液，但不再加酶而加入等量的去离子水，分别作为测定时的空白对照管。所有的试管都用水补足到0.8ml。,4.米氏常数（Km）的测定,6. DNS法精确检测,（3） 所有的试管按一定时间间隔加入0.2ml蔗糖（0.2mol/L)开始反应，反应10min后分别加入1 mL 1 mol/L NaOH终止酶促反应，加水杨酸试剂1ml，沸水浴精确反应5 min,冷却后定容至20 mL，然后测定A540的吸光值。,2、最适温度的测定 测定室温、30、40、50、60、70、80、 9
20、0不同温度下蔗糖酶催化和酸催化的反应速度。 每个温度准备1支试管，以乙酸缓冲液作为缓冲液。,6. DNS法精确检测,（1） 确定酶的稀释倍数，试管中加入0.2ml 0.2mol/L pH4.5的乙酸缓冲液，0.2ml稀释的酶，加水至0.8ml 加入1ml 10%的蔗糖开始计时，在室温下反应10min，后分别加入1 mL 1 mol/L NaOH终止酶促反应，加水杨酸试剂1ml，沸水浴精确反应5 min,冷却后定容至25 mL，然后测定A540的吸光值。 须得到0.20.3A的吸光度，准备一个水的空白对照管用于测定所有的样品管。,（2）测定上列各个温度下的反应速度，每次用1支试管，均加入0.2m
21、l乙酸缓冲液均用水调至0.8ml，放入水浴温度下使反应物平衡30秒，加入10%蔗糖0.2ml，准确反应10分钟，后分别加入1 mL 1 mol/L NaOH终止酶促反应，加水杨酸试剂1ml，沸水浴精确反应5 min,冷却后定容至25 mL，然后测定A540的吸光值。记录每个水浴的准确温度。,（3） 酶催化的各管A540 值均进行酸催化的校正。画出酶催化的反应速度对温度的关系曲线。,3.变性剂乙醇对游离酶活力的影响,4.米氏常数（Km）的测定,三、结果分析,1. 画出蔗糖酶活性与pH的关系曲线。 2.画出酶催化的反应速度对温度的关系曲线。3.画出乙醇对酶催化的反应速度影响的曲线。4.采用双倒数作
22、图法得出蔗糖酶的Km值。,实验四 蔗糖酶的固定化,一、实验原理,本实验用壳聚糖固定化酵母蔗糖酶属共价偶联法。 为了评价固定化方法的好坏，需进行酶回收率和酶相对活力的计算。,实验步骤,1.壳聚糖载体的制备及戊二醛的偶联（1）称取3 g壳聚糖溶于98 mL蒸馏水中，搅拌均匀，再滴加2 mL冰醋酸，搅拌至均匀的粘稠状；（2）称取8 g NaOH置大烧杯中，加入180 mL蒸馏水及20 mL甲醇。,（3）将拔出推塞的注射器架在铁架台上，倒入粘稠状的壳聚糖溶液，使壳聚糖溶液从20 cm高的注射器出口滴入大烧杯中，以制备壳聚糖微球载体。,（4）壳聚糖溶液滴加完毕后，静止片刻，待微球完全沉入烧杯底部时，反复
23、水洗多次至pH值中性，沥干水分。加入1%戊二醛溶液100 mL，静置2 h，使戊二醛偶联于壳聚糖载体上。,2.固定化酶的制备（1）将静置2 h后的壳聚糖微球载体中的戊二醛溶液倒掉，再用蒸馏水洗涤5次，以除去多余的戊二醛。（2）将实验一纯化得到的酵母蔗糖酶酶液1 mL用蒸馏水稀释至100 mL,与偶联戊二醛的壳聚糖载体混合，静置偶联过夜。,3.固定化酶的评价 分别测游离酶、固定化酶以及残留酶液的酶活力。,三. 结果分析,酶活回收率,=,固定化酶活力,游离酶总活力, 100%,酶的相对活力,=,固定化酶活力,游离酶活力 - 残留酶液活力, 100%,实验五 蔗糖酶的化学修饰,一、实验原理,N-溴代琥珀酰亚胺（NBS）能特异地修饰蛋白质分子中色氨酸残基的吲哚基团。 若色氨酸残基是酶活性中心的必需基团，那么经NBS修饰后，酶活性丧失的程度与修饰剂的浓度有化学计量关系。,在底物存在的情况下，修饰剂NBS不影响酶的活力。,P,NH,+,N,Br,O,O,P,NH,N,O,OH,+ HBr,吲哚基团 N-溴代琥珀酰亚胺 羟吲哚衍生物,氧化,pH4.5,二、实验步骤,取8只试管，编号，按下表操作：,三、结果分析,以NBS浓度为横坐标，相对活力为纵坐标绘制折线图，并分析不同浓度的NBS对酵母蔗糖酶活力的影响，得出结论。,
