1、第八章 园艺植物诱变与倍性育种,主要学习内容诱变育种的概念、特点和类别辐射诱变化学诱变突变体的鉴定、培育和选择多倍体育种多倍体倍性鉴定及应用单倍体育种,一、诱变育种的概念、特点和类别,1、诱变育种的概念利用物理和化学等因素诱发作物产生遗传变异，在短时间内获得有利用价值的突变体，根据育种目标要求，对突变体进行选择和鉴定，直接或间接地培育成生产上有利用价值的新品种的育种途径。,一、 细胞膜（cell membrane）,诱变育种的成就 日本诱变成功超级矮秆早熟水稻品种“黎明”；法国则诱变成功少粉行道树优良品种“无粉法国梧桐”，大大降低了游人的花粉过敏综合症。澳大利亚则育成不含多种异黄酮配糖体的三叶
2、草品种，使食草类牲畜的繁殖率大大提高。,一、诱变育种的概念、特点和类别,一、 细胞膜（cell membrane）,我国诱变育种于50年代后半期起步，40余年来年取得了很大的成就，据统计，近年来我国利用诱变或诱变与其他方法相结合，育成包括水稻、蔬菜、绿肥、观赏植物等作物新品种四百多个。其中在观赏植物领域的诱变育种成绩突出，在月季、菊花、荷花、大丽花、美人蕉等物种上育成并通过鉴定数十个商业化品种。,一、诱变育种的概念、特点和类别,二、 细胞质,3、诱变育种的特点3.1 诱变育种诱变效果受到一系列内外因素制约，难于实现定向突变。3.2 诱变结果一般局限于个别基因的表型改变。不同材料之间效果差异巨大
3、。因此，材料选择严格。一般选取生产上已经推广的高世代优良品系作为诱变材料。,一、诱变育种的概念、特点和类别,二、 细胞质,3.3 诱变条件下突变频率大幅度增加，但有利突变的几率低，因此，诱变后的群体应该保证足够大，需要较大的实验地、人力和物力。3.4 突变谱遵循一定的规律。同源平行变异规律对指导制定突变体育种目标具有重要的意义。3.5 诱变育种是无性繁殖园艺植物重要的育种手段。对有性繁殖植物育种来说，其增加的工作量几乎翻番。,一、诱变育种的概念、特点和类别,质体,4 诱变育种的意义和作用4.1 增加变异率，扩大变异谱 研究指出，人工诱变可使突变频率增加1,000倍左右。不仅突变的频率增加，而且
4、变异谱同时也有了很大的差异，并可将数量性状推向更高的水平。诱变可诱发自然界本来没有的全新类型，这样便可迅速丰富作物的“基因库”，从而扩大了选择范围，并提高了选择效果。,一、诱变育种的概念、特点和类别,一、诱变育种的概念、特点和类别,4.2 最适于进行“品种修缮 ” 在正确选择亲本和剂量等条件下，人工诱变有产生某种“点突变”的特点，它可以只改变品种的某一缺点，而不致损害或改变该品种的其他优良性状。而当进行杂交时，除了得到所希望的性状以外，同时有些不良性状也伴随而来。因此诱变育种适于用来进行“品种修缮” 工作，尤其是在加速育成抗病性品种方面有特殊的价值。,一、诱变育种的概念、特点和类别,4.3 缩
5、短育种年限 园艺植物中的多年生营养系品种，可通过直接处理营养器官，获得突变体后直接固定进行繁殖推广。该方法较常见的营养系杂交育种可大大缩短育种年限。,一、诱变育种的概念、特点和类别,4.4 克服远缘杂交不亲和性及改变植物的授粉、受精习性。 电离射线照射花粉可以克服某些远缘杂交的不亲和性；使异花授粉植物的自交不亲和变为自交亲和；可使正常可育的植物诱变成雄性不育系。,一、诱变育种的概念、特点和类别,5.诱变育种的类别5.1物理诱变：利用辐射，诱发基因突变和染色体变异。5.2化学诱变：应用有关化学物质诱发基因和染色体变异。,二、物理诱变,1 物理诱变的种类1.1 紫外线 辐射源是紫外光灯，能量和穿透
6、力低，能成功地用于处理花粉粒。以低压石英水银灯发出的紫外线照射效果较好。虽然紫外线穿透力较弱，但易被核酸吸收，能产生较强变异效果。1.2 X射线 辐射源是X光机。X射线又称阴极射线，分为硬X射线(波长较短)和软X射线。育种多用硬X射线。,二、物理诱变,1.3 射线 是一种比X射线波长更短的电离辐射线,辐射源是60Co和137Cs及核反应堆。射线也是一种不带电荷的中性射线。应用于植物育种的射线装置有照射室和圃场及钴人工气候照射室。各种照射场地均应设置防护墙。,二、物理诱变,1.4 射线 是一束电子流，每个粒子就是一个带负电荷的电子的射线束，由32P或35S等放射性同位素直接发生的。透过植物组织能
7、力弱，但电离密度大。通常配成溶液对处理器官或部位进行处理。当同位素溶液进入组织和细胞后作为内照射而产生诱变作用。,二、物理诱变,1.5 中子 辐射源为核反应堆、加速器或中子发生器。根据中子能量大小分为超快中子、快中子、中能中子、慢中子、热中子。能量从21MeV(百万电子伏）以上到小于1eV。中子的诱变能力比较强，育种上应用较多的是热中子和快中子。对多数作物来说，包括苹果，中子是比X或射线射线更有效的诱变剂 。,二、物理诱变,1.6 激光 激光和普通光相比，具有高方向性、高单色性和高亮度等基本特征 。一旦某种激光的频率和生物体内某种物质分子振动频率相等，就会产生很强的共振，使该物质分子对这种激光
8、产生吸收高峰。能量的积累，引起分子内化学键断裂。当这一分子与其它分子相互作用时，就会产生新的化学键，从而使化学性质发生改变，引起生物体性状的变异。,二、物理诱变,利用激光进行诱变育种研究，处理材料可以是植物的干种子或剥去种皮的裸胚、幼苗、根尖，也可以是未成熟的花器官、花粉及离体花药等。常用的激光器有CO2激光、N2激光、红宝石激光等，照射剂量一般采用1-50J/cm2，时间可以短到1秒，长至数小时不等。,二、物理诱变,1.7 离子注入诱变育种 能量为几十至几百keV的核能离子通过发生器注入生物体内，在其到达终位前，将同靶材料中的分子、原子发生一系列的碰撞。通过碰撞、级联和反冲碰撞，导致靶原子移
9、位，留下断链或缺陷。目前，离子注入植物品种改良已涉及几乎所有主要的粮食和经济作物。,二、物理诱变,河南省离子束诱变育种基地4兆伏静电加速器,二、物理诱变,离子束诱变在小麦上的应用,二、物理诱变,1.8 空间诱变育种 空间环境的显著特点是高真空、微重力和强辐射。研究表明，植物种子由卫星、高空气球搭载经空间飞行后会发生遗传性变异，而且这种诱变作用具有普遍性。我国自1987年以来7次利用返回式卫星搭载植物种子，从中获得了大量的变异类型，涉及到主要粮食及蔬菜作物，并已培育出一些新的突变类型和具有优良农艺性状的新品系 。,二、物理诱变,二、物理诱变,福建省农科院谢华安院长等通过航天诱变育的优航中稻,二、
10、物理诱变,2、辐射处理的剂量单位和剂量率2.1 放射性强度 放射性强度以毫居里（mCi）或微居里（Ci）表示，分别相当于10-3Ci和10-8Ci。现在为了统一标准，便于国际上互相比较，采用了新的照射剂量单位。但是迄今发表的试验报告仍习用于一般常用的剂量单位。新的照射单位为贝可（Bq，Beequare），即1Bq/sec2.70310-11Ci。 适用于植物体内辐射强度的度量。,二、物理诱变,2.2 剂量强度 指受照射的物质每单位质量所吸收的能量，即物质所吸收的能量/物质的质量。照射的剂量单位有：2.2.1 照射剂量以伦（即伦琴，R）表示，是和射线的剂量单位，新的照射剂量单位为1库伦（Coul
11、omb）/kg，相当于3.876103 R。2.2.2 吸收剂量以拉特（Rad）表示，即组织伦琴。新的吸收剂量单位为戈瑞（Gray），相当于1焦耳（Joule，J）/千克或100Rad。2.2.3 中子流量以单位平方厘米的中子数（n/cm2）表示。,二、物理诱变,2.2 剂量率 在照射处理时，处理材料在单位时间内所受到的剂量过大，可以显著影响幼苗成活率和生长速度。所以用剂量率（dose rate）作为单位来衡量，即单位时间内所吸收的剂量。一般情况下突变与剂量率关系不是很大。通常干种子的剂量率为60100R/min，花粉为10 R/min左右，剂量率不应超过160R/min。,二、物理诱变,3
12、辐射诱变机理3.1 物理作用阶段 生物有机体内的遗传物质某分子部位受到不同能量辐射后，可能产生不同的核物理效应。“光电效应”和“康普顿一吴有训效应”。而当受到的辐射能量足以使该电子脱离原子核吸引,则会导致“离子对生成”。这些变化均是在物理状态下进行的。,二、物理诱变,3.2化学反应阶段当被照射后的遗传物质分子失去电子或得到电子后，则形成“离子对”及“自由基”，其活跃程度大大增强，带不同电荷的基团极有可能发生分解或聚合反应，从而导致新的化学成分产生。 有时这种电离现象和离子对形成不是直接发生于DNA分子上，而是与之相邻的分子或水分子，从而产生具有强氧化或还原能力的基团（如HO、O、H2O2、H等
13、）。这些基团进一步作用于遗传物质，引发DNA的各种异常，人们常称这种效应叫“间接效应”。,二、物理诱变,3.3 生物学阶段 当遗传物质本身受到辐射后，电离和分子重组的结果可能导致DNA断裂、交换、畸变，直接影响了DNA复制或碱基序列改变，从而导致遗传上的变异，人们往往称这种效应为“直接效应”。,二、物理诱变,从上述三个可能发生的阶段来看，化学变化及生物学变化的发生并非是必然的。 当受辐射部位得到的能量较小时，可能只发生物理作用阶段，而不导致生物学变化，这也就说明了为什么正常的日光照射并不能诱发生物产生变异，也是生物稳定遗传的基本保障。,二、物理诱变,植物的辐射敏感性和诱变剂量4.1 测定辐射敏
14、感性的指标 植物对辐射的敏感性是指植物体对电离辐射作用的敏感程度。用以衡量敏感性的指标，因植物种类、照射方法及研究目的不同而不同。最常用的指标有：出苗率、存活率、生长受抑制程度、结实率、细胞状态、染色体畸变率等。,二、物理诱变,4.2 植物辐射的敏感性差异4.2.1 不同植物辐射敏感性不同豆科植物最敏感，禾本科次之而十字花科植物则最不敏感。十字花科作物不敏感，主要是种子内含有对辐射有屏障作用的丙烯芥子油造成的。不同科、属、种间敏感性的差异主要来自遗传物质的不同和生理生化特性的差异。通常是染色体大的，DNA含量高的植物辐射敏感性高。,二、物理诱变,4.2.2 不同品种类型的敏感性差异 这种差异比
15、科、属、种间差异要小。作物的耐辐射（不敏感）程度依次为：杂交种常规品种自交系。,二、物理诱变,4.2.3 同种作物的不同发育期对辐射敏感性的差异 休眠种子和枝条不敏感，而萌动种子和发育中的枝条则敏感。分化成的细胞不敏感，而正在分生中的细胞则敏感。在种子发育过程中，乳熟期最敏感，蜡熟期次之，完熟期则不敏感。,二、物理诱变,4.2.4 不同组织和器官敏感性有差异 如洋葱正在生长的根最敏感，休眠鳞茎次之，干种子胚最差，这种差别与植物体内的含水量有较大关系。,二、物理诱变,5 植物的诱变剂量 可根据“活、变、优”三方面要求灵活加以掌握。活后代要有一定的成活植株；变在一定的成活植株中，有较大的变异效应；
16、优产生的变异有较多的有利突变。一般认为，照射种子或枝条最好的照射剂量应选择在临界剂量附近，即被照射的种子或芽成活率为40%；或半致死剂量，即辐射后成活率为50%；若处理材料为整株苗木，可选半致矮剂量，即辐射后生长量减少至对照的50%左右。,二、物理诱变,二、物理诱变,二、物理诱变,二、物理诱变,辐射诱变的方法6.1 外照射 指放射性元素不进入植物体内，而是利用其射线（X射线、射线、中子）照射植物整个器官。这种方法简便，在诱变育种中比较常用。,二、物理诱变,6.1.1 种子照射 可采用干种子、湿种子或萌动的种子进行照射。照射种子操作简单，体积小，处理数量多，并易于贮存和运输。但从播种到开花结果时
17、间长，植株占地面积大。供照射的种子材料应预先经过精选，要求有较高的纯度，不含夹杂物。照射后应及时播种，过早进行种子照射处理，容易产生贮存效应。（如用干燥种子照射，并在干燥有氧条件下贮存，可使损伤加剧） 。,二、物理诱变,6.1.2 花粉照射 花粉照射的最大优点是很少产生嵌合体，经辐射的花粉一旦产生突变，与卵细胞结合所产生的植株即是异质结合体。照射前使花粉水合或照射未成熟的花粉，能增加诱变剂的效率。 保加利亚的A.Angelor（1981）用射线照射后的桃子Duphishka的花粉和Halle杂交，获得高产、大果、质优的Plovdiv6新品种。,二、物理诱变,6.1.3 营养器官照射此法多用于无
18、性繁殖的植物作为播种、扦插、嫁接材料的处理。如蔬菜作物中的马铃薯块茎、洋葱鳞茎、山药块根；果树作物的嫁接接穗、观赏作物的地下球等。,二、物理诱变,6.1.4 子房照射 照射子房也具有不易产生嵌合体的优点，辐射处理子房不仅有可能诱发卵细胞突变而且可能影响受精作用，诱发孤雌生殖。对自花授粉植物应先去雄，辐射后用正常花粉授粉。,二、物理诱变,6.1.5 其它器官照射 由于离体培养技术的发展，采用愈伤组织、单细胞、原生质体以及单倍体等材料进行辐射处理，可以避免或减少嵌合体的形成，已日益受到重视。,二、物理诱变,6.2 内照射 将辐射源引入到试材内部的照射叫内照射。 这种照射方法的优点是不需建造成本很高
19、的设施，但不足是需要防护条件，易造成环境污染，处理剂量不易掌握，受一定限制。,二、物理诱变,6.2.1 浸泡法 将放射性同位素32P、35S等配成一定比例浓度的溶液，浸泡种子或枝芽，使放射性物质渗入组织内部进行照射。,二、物理诱变,6.2.2 注射或涂抹法 将放射性同位素溶于粘性剂中（如羊毛脂、凡士林、琼脂等），取适量涂抹于处理部位（如生长点、腋芽、花蕾、芽眼等处）。,二、物理诱变,6.2.3 施肥法 将放射同位素的化合物以无机肥（如32P、35S、45Ca的化合物磷酸二氢钾、硫酸铵、硝酸钙等），通过作物根部施肥引入植株体内进行处理。6.2.4 注射法 用微量注射器将适宜浓度的试剂溶液注入处理
20、部位进行诱变，多用于花蕾、芽、块茎、鳞茎等试材的处理。,三、化学诱变,能与生物体的遗传物质发生作用，并能改变其结构，使其后代产生变异的化学物质称为化学诱变剂。,1 化学诱变剂种类 1.1 烷化剂 这类试剂的共同特点是携带一至多个活跃的烷基，通过“烷化作用”的方式将DNA或RNA分子结构中的H原子置换，从而导致“复制”或“转录”过程中“遗传密码”的改变，进而发生变异。,三、化学诱变,三、化学诱变,三、化学诱变,1.2 核酸碱基类似物 这一类化学物质具有与DNA碱基类似的结构，它们可以在不妨碍DNA复制的情况下，作为组成DNA的成分渗入到DNA分子中去，使DNA复制时发生偶然的配对上的错误，从而引
21、起有机体的变异。常用的有5-溴尿嘧啶（BU）、5-溴去氧尿核苷（BUdR）、2-氨基嘌呤（AP）、马来酰肼（MH）等。,三、化学诱变,5-溴尿嘧啶,胸腺嘧啶,三、化学诱变,1.3 抗生素 如链霉黑素、丝裂霉素C和重氮丝氨酸等。 抗生素类的主要诱变机理是抗生素对DNA核酸酶的破坏作用，影响了DNA合成及分解的有序性，进而造成染色体断裂。,三、化学诱变,1.4 生物碱 一些中草药及观赏植物的种子或组织中也发现一些诱变物质，常见的有秋水仙碱、石蒜碱、喜树碱、长春碱等。 生物碱诱变作用主要通过影响细胞有丝分裂过程，阻止纺锤丝和赤道板形成，使细胞分裂中期异常停止，抑制rRNA合成及导致染色体畸变等。,三
22、、化学诱变,1.5 其它诱变剂 报道过的药剂种类很多，如亚硝酸在pH5以下的缓冲液中，能使DNA分子的嘌呤和嘧啶基脱去氨基，使核酸碱基发生结构和性质改变，造成DNA复制紊乱。此外尚有报道羟胺（NH2OH）、氮蒽、叠氮化钠（NaN3）等物质，均能引起染色体畸变和基因突变。尤其是叠氮化物在一定条件下可获得较高的突变频率，而且相当安全，无残毒。,三、化学诱变,三、化学诱变,2 化学诱变剂的诱变特点2.1 能诱发更多的基因点突变2.2 诱变有一定专一性：某些试剂只能在某种作物、某个生长发育时期、某些DNA片段，甚至某种碱基位点上才起诱变作用。,三、化学诱变,2.3 使用方便，成本较低。2.4 诱变剂只
23、有渗透到植物组织内部才能起作用。对一些组织致密，有鳞片和茸毛包裹、高度蜡质化、角质化的器官效果不理想。,三、化学诱变,3.化学诱变的方法3.1药剂的配制诱变处理时通常先将药剂配成一定浓度的溶液。有些药剂在水中不溶解，如硫酸二乙酯溶于70%的酒精，可先用少量酒精溶解后再加水配成所需浓度。 适宜pH：许多试剂的水溶液极不稳定，易产生水解生成酸性或碱性物质而变性。因此，选用适宜pH的磷酸缓冲液是确保诱变效果的重要条件。,三、化学诱变,3.3 试材预处理 在化学诱变剂处理前，将干种子预先用水浸泡，可以提高其对诱变的敏感性。试验证明，浸泡能提高细胞膜透性，加速诱变剂的吸收，同时使细胞代谢活跃起来，并促进
24、DNA的合成，这个现象称为水合作用。,三、化学诱变,3.3 药剂处理方法3.3.1 浸渍法 将种子、枝条、块茎等浸入一定浓度的诱变剂溶液中，或将枝条基部插入溶液，通过吸收使药剂进入体内。,三、化学诱变,3.3.2 涂抹或滴液法 将药剂溶液涂抹或缓慢滴在植株、枝条或块茎等处理材料的生长点或芽眼上。3.3.3 注入法 用注射器将药液注入材料内，或先将材料人工刻伤成切口，再用浸有诱变剂溶液的棉团包裹切口，使药液通过切口进入材料内部。,三、化学诱变,3.3.4 熏蒸法 在密封的容器内使诱变剂产生蒸汽，对花粉等材料进行熏蒸处理。3.3.5 施入法 在培养基中加入低浓度诱变剂溶液，通过根部吸收进入植物体。
25、,三、化学诱变,4 药剂处理后的漂洗 经药剂处理后的材料必须用清水进行反复冲洗，使药剂残留量尽可能地降低以终止药剂处理作用，避免增加生理损伤。一般约需冲洗10-30分钟甚至更长时间。常用的清除剂有硫代硫酸钠等。经漂洗后的材料应立即播种或嫁接，有些不能立即播种而需暂时贮藏的种子，应经适当干燥后贮藏在0左右低温条件下。,三、化学诱变,5 影响化学诱变效应的因素5.1 浓度和处理时间 考虑低温低浓度长时间处理，被处理植株成活率高，突变频率高。 考虑药剂水解半衰期（如烷化剂），中途添加新溶液进行补充。,三、化学诱变,5.2 处理温度 先在低温（0-10）下把种子浸泡在诱变剂中足够的时间，使诱变剂进入胚
26、细胞中，然后把处理的种子转移到新鲜诱变剂溶液内，在40下进行处理以提高诱变剂在种子内的反应速度。,三、化学诱变,5.3 溶液pH及缓冲液的作用 由于部分诱变剂在不同的pH条件下发生不同水解反应而在处理效果上出现差异。因此，考虑适度的溶液酸碱度平衡（磷酸缓冲液）是非常必要的。5.4 使用安全问题 诱变剂都有程度不同的毒性，有的是潜在的致癌剂。因此在处理时应该避免与皮肤接触或吸入它的气体，一般多在具有通风密闭的专用操作平台并戴乳胶手套进行。,四、突变体的鉴定、培育和选择,1 处理材料的选择1.1材料的选择1.1.1首先必须根据育种目标来选择亲本材料。 为了实现不同的育种目标，应选用不同特点的亲本材
27、料进行诱变处理，例如为了选育抗病毒病（TMV）的番茄优良品种，则亲本材料应该是丰产、优质、成熟期适宜，并能抵抗除病毒以外的其他主要病害的品种，否则便不易达到预期的育种目的。,四、突变体的鉴定、培育和选择,1.1.2 亲本材料必须是综合性状优良而只具有个别需要改进的缺点。 因为诱变育种的主要特点之一是它最适于改善某一品种的个别不利特性（即产生单个基因的突变）。为此通常可选用当地生产上推广的良种或育种中的高世代品系作诱变材料。,四、突变体的鉴定、培育和选择,1.1.3 为了增加诱变育种成功的机会，选用的处理材料应避免单一化。 因为不同的品种或类型，其内在的遗传基础存在着差异，它们对辐射的敏感性不同
28、，因而诱变产生的突变频率、突变类型、优良变异出现的机会和优良程度也有很大差别，故应在人力、土地等条件许可下，适当多选几个亲本材料为好。,四、突变体的鉴定、培育和选择,1.1.4 适当选用单倍体、原生质体和多倍体等作诱变材料 用单倍体作诱变材料，发生突变后易于识别和选择。突变一经选出，将染色体加倍后即可使突变固定和纯化，故可显著缩短育种年限。 多倍体提高了忍受染色体畸变的能力，减少了突变体的死亡率，使突变体的后代获得较多的变异，故也可选用多倍体品种作材料。,四、突变体的鉴定、培育和选择,1.2 处理部位的选择 处理部位的选择应有利于物理或化学诱变剂最大限度地发挥诱变作用。一般来说，应选择敏感性强
29、的部位：芽、生长点、花粉、花药、子房、分生组织等。,四、突变体的鉴定、培育和选择,2 诱变剂量的确定 一般参考过去研究者的结果或在温室内测定幼苗高度。采用或射线等低密度射线，以降低30%50%苗高为较适宜的剂量；高密度电离辐射的中子，则只要降低15%30%的苗高，化学诱变剂要求降低10%30%的苗高为适宜剂量。,四、突变体的鉴定、培育和选择,3 处理群体大小的确定 一般是根据突变率和M2群体大小来确定处理试材群体大小。像蔬菜等小粒作物，群体应在10000株以上。 要求M2获得特定的有益性状突变体，其频率是很低的，可能只有万分之一。如果以半致死剂量为准，则处理5000粒种子，可得到2500存活（
30、M1）株。如果每株产生20粒种子，则第二代（M2）有5万株可加以选择。,四、突变体的鉴定、培育和选择,4 突变体的鉴定4.1 形态鉴定 目测或借助简单工具进行发芽率、植株高矮等调查，记载。4.2 细胞学鉴定 用植株的初生根系鉴定染色体的结构变异。,四、突变体的鉴定、培育和选择,4.3 利用DNA分子标记技术检测突变体。,四、突变体的鉴定、培育和选择,5 诱变处理后代的选择5.1 M1的种植和选择 以种子为试材的诱变处理为例，将诱变处理的种子，按不同的剂量分别播种称为M1，不必进行选择淘汰，全部留种。对M1植株并应实行隔离，使其自花授粉，以免有利突变因杂交而混杂。,四、突变体的鉴定、培育和选择,
31、5.2 M2的种植和选择 根据M1代的收获方式相应种植成M2代。由于诱变所得的M1常为“嵌合体”，故对M1最好能分穗或分果实分别采收种子，然后每穗（果）分别播种成一个小区称为“穗系区” 。由此可见，M2的工作量是辐射育种中最大的一代，为了获得有利突变，通常M2要有几万个植株，每一M1个体的后代（M2）种植2050株。,四、突变体的鉴定、培育和选择,5.3 M3及以后各世代的种植和选择 将M2中各变异株分株采种，分别播种一个小区，称为株系区，以进一步分离和选择，一般在M3就可确定是否真正发生了突变，且该突变能否遗传。在M3中鉴定淘汰不良的“株系”，在优良的“株系”中再选出最优良的单株。 将优良M
32、3株系中的优良单株分株播种成为M4，在其中进一步选择优良的“株系”，优良株系升级比较，进行品系比较试验、生产示范试验和区域试验。,四、突变体的鉴定、培育和选择,6 以营养器官（接穗、插条、薯块等）为试材的种植与选择处理6.1分离繁殖法 根据实践经验，果树休眠芽基部叶原基的叶腋分生组织中细胞很少，辐射处理通常可产生较宽的突变扇形体。其初生枝基部腋芽，通过重复分离繁殖，可以使突变扇形体继续生长扩大，这样有可能将同质突变体从嵌合状态分离出来。,四、突变体的鉴定、培育和选择,6.2 修剪法 在分离繁殖的同时结合进行短截修剪，特别是顶端生长占优势的植物，修剪可以促进基部隐芽萌发或产生不定芽，有利于内部变
33、异体组织暴露出来。,四、突变体的鉴定、培育和选择,6.3 组织培养法 诱变处理的材料如果采用组织培养技术，可以大大提高变异率，而且有可能避免或减少嵌合体干扰，更加彻底地暴露内部的变异体组织，提高诱变效果。不同细胞的生长和发育状况不同，其诱变效应不一。通过组织培养为不同变异的细胞提供发育机会。如果各种变异的细胞都能发育，大大提高诱变效果，为选择提供大量的材料。,五、倍性育种的相关概念,1 倍性育种的相关概念 染色体是遗传物质的载体，染色体数目的变化常导致植物形态、解剖、生理生化等诸多遗传特性的变异。各种植物的染色体数是相对稳定的，但在人工诱导或自然条件下也会发生改变。,1.1倍性:是指在生物一个
34、细胞内所含有染色体组(或称基因组)的数目。1.2染色体组:一个属内各个种所特有的、维持其生活机能的最低限度数目的一组染色体。1.3染色体基数:每个染色体组所包含的染色体数。1.4 多倍体:多于两个染色体组的生物体的统称。1.5单倍体:体细胞核内具有一个染色体组的生物体。 体细胞染色体称为为2n，性细胞染色体称为n。n有时正好为一个染色体组（即该物种的染色体基数x），有时却含有两个或两个以上的染色体组。,五、倍性育种的相关概念,倍性育种 就是研究植物染色体倍性变异的规律并利用倍性变异选育新品种原理及方法的科学。2、倍性变异的类型2.1 整倍体变异：植物染色体数目出现与染色体基数呈倍数性关系的变异
35、。结果是产生多倍体和单倍体。2.2 非整倍体变异：植物染色体数目变化不与染色体基数成倍性关系的变异。其结果是产生单体、缺体、三体、四体等植物。,五、倍性育种的相关概念,五、倍性育种的相关概念,目前最常用的是整倍体，包括两种形式，一是利用染色体数加倍的多倍体育种，二是利用染色体数减半的单倍体育种 。,南瓜单倍体植株,金银花多倍体,六、多倍体育种,1 多倍体的种类 根据染色体的来源，多倍体一般可分为两大类1.1 同源多倍体 多倍体的几组染色体全部来自同一物种，或者说由同一个物种的染色体组加倍而成。如AAA-同源三倍体，AAAA-同源四倍体 1.2 异源多倍体 凡由 2 个或 2 个以上来自不同种属
36、的染色体组所形成的多倍体，称异源多倍体。 如由不同种、属间个体杂交得到的F1再经染色体加倍得到。如AABB-异源四倍体（又叫双二倍体）,六、多倍体育种,2 多倍体的特点2.1 同源多倍体育性差，结实率低或不能结实 由于同源多倍体染色体组来自同一个物种，细胞内有两个以上的同源染色体，减数分裂时可联会形成多价体，使减数分裂行为出现异常现象，同源三倍体会高度不育，同源四倍体部分不育。,六、多倍体育种,如甘薯，同源六倍体马铃薯，同源四倍体香蕉，同源三倍体,六、多倍体育种,2.2 异源多倍体高度可育 异源多倍体的染色体由两个或两个以上不同物种的染色体所组成，减数分裂时同源染色体能正常联会，不出现多价体，
37、使减数分裂行为正常，高度可育。,六、多倍体育种,苹果、梨、樱桃、菊、水仙、郁金香等都属于异源多倍体。,六、多倍体育种,2.3 器官的巨型性 多倍体植株不一定很高大，但一般茎秆茁壮、枝叶少、叶色深、叶片宽厚、花器大、花瓣多、花色深艳，多倍体植株的花形大小常与染色体数目呈明显正相关。,六、多倍体育种,2.4 杂合体自交后代中纯合体的机率较低，同源多倍体达到遗传平衡的时间也较长。2.5 与二倍体相比生长缓慢，开花晚，种子不饱满。2.6 多倍体抗病性、抗逆性强于二倍体。在蛋白质、碳水化合物、维生素等含量方面明显高于二倍体。如多倍体从赤道到极地都有分布；高山上多倍体多；在炎热夏季的稻田里常发现多倍体花粉
38、粒。如四倍体番茄Vc含量比二倍体高一倍。四倍体紫罗兰、桂竹香芳香性强、蜜腺多。,六、多倍体育种,3 多倍体育种的意义3.1 获得某一物种器官相对的巨大性，提高营养成分含量降低可育性以及提高抗性强等。,六、多倍体育种,3.2 通过染色体加倍，克服远缘杂交的困难 。 在育种实践中，通过诱导多倍体作为不同倍性间或种间的遗传桥梁，是进行基因转移或渐渗的有效手段。,草莓染色体加倍比较,六、多倍体育种,3.3利用同源多倍体稔性差的特点，选育无籽或少籽果实。,二倍体和四倍体葡萄果实,三倍体无籽西瓜,六、多倍体育种,4 多倍体的诱导与育种4.1 诱导材料的选择4.1.1选用主要经济性状优良的品种 多倍体的遗传
39、性是建立在原低倍材料基础上的，染色体加倍后，只能使其原有性状得到加强或减弱，而不会产生新性状，所以要获得优良的多倍体品系，必须挑选优良的亲本。,六、多倍体育种,4 .1.2 选用染色体数目少的材料 染色体数少的植物对染色体加倍的反应较好，特别是二倍体植物较易引变成多倍体。一般认为，超过六倍体水平以上的多倍体，往往是无益的。 因为染色体组数多的种在进化过程中已经利用了自身的特点，再对其诱变选优较为困难，因此处理前应了解染色体组数及近源物种的多倍性化的程度。,六、多倍体育种,4.1.3、单性结实或以收获营养器官为目的的作物。 由于同源多倍体具有结实率低、种子不饱满等缺点，因此对以种子为收获目的或繁
40、殖手段的园艺植物来说，应用难度大，但对部分以无性繁殖为手段、以营养器官为收获目的的蔬菜、果树、观赏植物来说，诱导的多倍体易于应用。,六、多倍体育种,4.1.4 选用多个品种进行处理 不同的种、品种，由于遗传基础不同，多倍化后的表现不同，处理材料多较易获得成功。,六、多倍体育种,5、多倍体诱导的途径和方法5.1 利用物理因素诱导多倍体 物理因素包括温度剧变、机械创伤、电离射线、非电离射线、离心力等。利用X 射线、 射线、中子等辐照处理，在促使染色体数目加倍的同时，可能引起染色体的损伤、断裂、丢失等。,六、多倍体育种,5.2 利用化学因素诱导多倍体 化学法的药剂主要有秋水仙碱、富民隆、萘嵌戊烷等，
41、以秋水仙碱效果好、应用多。许多育种学家在20世纪30年代，开始积极地用秋水仙素诱导多倍体。,六、多倍体育种,富民隆诱导多倍体 鲍文奎（中国八倍体小黑麦的发明者）在1961 年，发现了一个新的多倍体诱变剂。药品的名字是富民隆，或称对甲苯磺硫苯胺基苯汞，它是一个杀菌剂，加倍染色体数的效果和秋水仙素一样。,六、多倍体育种,富民隆，为灰白色粉末，不溶于水，可将其溶于丙酮后加入蒸馏水，配成0.1%的乳白色悬浊液备用。一般用于处理萌动的种子，使用浓度为0.01-0.03%，在10-36条件下处理2-4天，冲洗后即可移植或播种。价格低廉，应用方便。,六、多倍体育种,5.3 利用2n 配子获得多倍体 通过有性
42、杂交可以产生多倍体，其原因之一是亲本形成配子之前染色体数没有减少，而是形成2n配子，甚至3n、4n等多倍体配子，在一些突变体及远缘杂交F1中存在较多。,六、多倍体育种,5.4 胚乳培养在被子植物中，胚乳是双受精的产物，当雄配子进入胚囊时，由两个极核和一个雄配子融合而形成的胚乳核发育而成，所以在倍性上大多属于三倍体。1982年用组织培养方法培养锦丰梨的幼胚胚乳，获得锦丰梨三倍体植株。后在水稻、苹果、柚、马铃薯和猕猴桃等作物上也获得成功。台湾园艺学者在百香果、石蒜上也获得了胚乳培养三倍体植株。但胚乳植株不一定都是三倍体植株，而往往出现混倍体 。,六、多倍体育种,石蒜,百香果,六、多倍体育种,5.5
43、 细胞融合 细胞融合，也称体细胞杂交，是用人工的方法把分离的不同属或种的原生质体诱导成为融合细胞，然后再经离体培养、诱导分化到再生完整植株的整个过程。上海植生所培育的芹菜与胡萝卜远缘杂交种即用此法。,六、多倍体育种,5.6 体细胞无性系变异 体细胞无性系变异是来源于体细胞中自然发生的遗传物质的变异。这种体细胞突变有时也会出现染色体数目的变异，形成多倍性芽变。 如四倍体大鸭梨就是二倍体鸭梨的芽变，葡萄四倍体大粒玫瑰香是二倍体玫瑰香的芽变。,六、多倍体育种,6 秋水仙素诱发多倍体6.1 秋水仙碱诱发多倍体的原理 秋水仙碱是从百合科秋水仙的器官和种子中提取的一种药剂，性极毒，分子式为C22H25NO
44、6。一般是呈淡黄粉末，有苦味，易溶于冷水、酒精、氯仿和甲醛，不易溶于乙醚和苯。,六、多倍体育种,其作用在于，当它与正在分裂的细胞接触后，使分裂的细胞核纺锤丝立即缩小，染色体不向两极移动，而停止在细胞分裂中期，从而产生染色体加倍的核。它对染色体结构无显著影响；浓度合适时，对细胞毒害不大。,六、多倍体育种,6.2 秋水仙碱诱发多倍体的原则6.2.1 处理材料 有效地诱变刺激，只发生在细胞分裂活跃状态的组织。因此，要想获得成功的多倍体植株，以处理萌动的种子、子叶生长点、花蕾、幼苗为宜。,六、多倍体育种,6.2.2 处理浓度 常用的浓度0.01%-1.0%，以0.2%最常用。秋水仙素通常配成水溶液。配
45、制时，一般是先配成浓度高的母液，到临用时再加蒸馏水稀释至所需要的浓度。药液宜盛于有色玻璃瓶内，盖紧并置放暗处，可较长期保存而不致降低药效。在药液中加入1%-4%的二甲基亚砜作载体剂，能促进秋水仙素对植物组织的渗透，提高染色体加倍效果。,六、多倍体育种,6.2.3 处理时间 发芽种子数小时至3-10d；处理插条、接穗一般1-2d。6.2.4处理温度 处理期间的温度是否适宜对处理的成功率影响很大，高温往往不利，一般控制在20 左右。,六、多倍体育种,6.3 处理方法6.3.1浸渍法 可浸渍幼苗、新梢、种子、球根。种子、球根处理后应冲洗干净后播种。百合鳞片用秋水仙素处理1-3小时后扦插，可得到四倍体
46、球芽；唐菖蒲实生小球也可用浸渍法获得四倍体植株。,六、多倍体育种,6.3.2 涂抹法 配成一定浓度的乳剂，涂于幼苗、枝条的顶端。处理部位要适当遮盖，减少蒸发并防雨 。如加入甘油、凡士林等。 6.3.3、滴液法 对较大植株的顶芽、腋芽处理时可采用此法。常用浓度为0.1%-0.4%，每日滴1 至数次，反复处理数日。如溶液在上面停不住，可将小片脱脂棉包裹功芽，再滴液。适用于大的植物的顶芽、腋芽的处理。,六、多倍体育种,6.3.4 套罩法 保留新梢的顶芽，除去顶芽下面的几片叶，套上一个防水的胶囊，内盛有含1%秋水仙碱的0.65%的琼脂，经24h 即可去掉胶囊。6.3.5 其它方法 如毛细管法、注射、喷
47、雾、培养基法等。目前采用秋水仙素加入培养基进行组织培养诱导的方法正被广泛使用。,六、多倍体育种,6.4 处理注意事项6.4.1 幼苗生长点处理愈早，获得正常加倍的细胞数目越多，处理过晚，则获得的多是嵌合体。 6.4.2 处理后生长会受到抑制，因此应加强处理后的培育和管理。6.4.3 处理数量要多，以利于选择有利的变异个体。6.4.3 处理后应用清水冲洗，避免药效残留的影响。6.4.5 秋水仙素具有巨大的毒性，使用过程中应注意安全。,七、多倍体倍性鉴定,1 多倍体的鉴定 1.1外部形态比较 特点是直观、简便。可将整体、叶片、茎、果、花、种子等进行比较。 如瓜类多倍体表现：发芽和生长缓慢；子叶及叶
48、片肥厚、色深、茸毛粗糙而较长；叶片较宽、较厚或有皱褶；茎较粗壮、节间变短；花冠明显增大，花色较深；果实变短、变粗、果肉增厚、果脐增大（甜瓜）；种子增大，嘴部变宽，但种仁饱满。,七、多倍体倍性鉴定,七、多倍体倍性鉴定,金银花多倍体的巨大性,果树多倍体一般茎变短、叶变厚，叶形指数变小；颜色变深，表面皱缩粗糙、生长缓慢；花、果变大，可育性低。,七、多倍体倍性鉴定,七、多倍体倍性鉴定,1.2 气孔鉴定 多倍体的气孔较二倍体大。这是一种较为可靠的鉴定方法。但是处理和对照必须在同一发育时期和同一外界条件下才可比较判断。,七、多倍体倍性鉴定,烟草二倍体、四倍体、八倍体叶片表皮细胞比较,七、多倍体倍性鉴定,1.3 花粉粒鉴定 与二倍体相比，多倍体花粉粒体积大，生活力低。有些多倍体甚至完全不育，如三倍体。但不同的植株类型及多倍体的不同倍数，其不孕的程度存在差别。如双二倍体就比产生它的杂种二倍体结实率高。,
