1、三维细胞培养技术的研究与应用【摘要】 三维细胞培养技术是在二维细胞培养和动物实验模型的基础上发展起来的简单、有效的细胞培养方式。利用三维细胞培养技术可以更好的模拟体内微环境，为相关研究领域提供新的手段。目前，三维细胞培养技术在组织工程、肿瘤学、再生医学和干细胞生物学等研究领域均有应用。该文就近年来三维细胞培养技术的发展及应用进行综述。【关键词】单层细胞培养;三维细胞培养;人工脉管自 Willhelm Roux 于 1885 年从鸡胚中分离细胞首次建立体外细胞培养，单层细胞培养技术己有百余年的历史。一个多世纪以来，单层细胞培养有了蓬勃的发展，特别是在制药或者疫苗合成等产业化领域，通过细胞的快速分
2、裂，从而高效率地制造产品。但在生命科学基础研究领域，对于细胞的体外培养，关注的不仅仅是它们的分裂生长，而更为重要的是它们经过传代后能否维持体内的性状。在很多情况下，单层细胞培养技术所取到的研究结果和体内的情况不符合，因为细胞在体外改变的环境下增生，逐渐丧失了原有的性状。动物实验完全在体内讲行,但由干体内的名种因素制约以及体内和外界环境相互影响而变得复杂化，难以研究单一过程。另外，我们在动物身上所观察到的结果，往往是最终呈现的表现，而非研究者最为关心的中间过程。显然，如何填补单层细胞培养和动物实验的鸿沟，一直是生命科学家思索的问题。尤其是在发育生物学领域，迫切需要建立一套细胞培养技术，既能生长传
3、代，还能最大程度地维持体内性状，并分化产生新的组织结构，以便全面研究发育过程。随着组织工程的新兴发展，三维细胞培养技术就应运而生了.1 什么是三维细胞培养技术体外细胞培养的一个重要原则是需模拟体内细胞生长环境，该模拟系统中最重要的核心因素是细胞与培养环境之间的相互作用。不同于传统的二维化单层细胞培养，三维细胞培养技术(TDCC)是指将具有三维结构不同材料的载体与各种不同种类的细胞在体外共同培养，使细胞能够在载体的三维立体空间结构中迁移、生长，构成三维的细胞载体复合物。三维细胞培养是将细胞培植在一定的细胞外基质中，细胞外基质(ECM)蛋白充当生长支架，使得细胞能够分化产生一定的三维组织特异性结构
4、，所创建的细胞生长环境，则最大程度地模拟体内环境.TDCC 作为体外无细胞系统及单层细胞系统的研究与组织器官及整体研究的桥梁，显示了它既能保留体内细胞微环境的物质及结构基础，又能展现细胞培养的直观性及条件可控性的优势。近几年三维细胞培养技术在组织形成、血管发育和器官再造等发育生物学的分支领域得到了广泛的应用;同时在筛选新药的疗效分析和毒理实验方面，利用三维培养获得了和二维单层培养完全不同的结果，引起了药物学家的极大兴趣。2 三维细胞培养支架材料现有的第 1 代三维培养系统运用人工合成的生物高分子微纤维支架，比如聚乳酸轻基乙酸、壳多糖等，从而模拟三维微型生活环境，自三维培养系统问世以来就投入实际
5、运用。但合成高分子的降解产物可能危害细胞生长。后来主要以更接近体内的 ECM 如胶原蛋白作为生长支架，并且多用含有血清的培养基孵育细胞，由于 ECM 和血清中包含大量未鉴定组分，尤其是目前实验室大量运用的 ECM 是商业上所获得的 Matrigel，Matrigel 是从小鼠肿瘤组织中提取的抽提物，这为三维培养介导的针对人体的干细胞临床治疗带来了风险。最近，作者所在的研究组在世界上首创植入人体后无任何副作用并能被降解的聚脂羊毛作为“人工脉管”代替 ECM 生长支架，且运用完全不含血清的 DMEM 化学培养基培植干细胞，从而建立了完全可控制的生长环境。这种第 2 代三维培养技术，排除了 Matr
6、igel 和血清(由于未经过彻底检测而可能污染 prion)带来的风险因素，为干细胞临床治疗奠定了安全前提。人工脉管模拟体内环境，由细小的纤维、间隙和孔洞组成，氧气、激素和营养成分得以通过，而废物可以从里面过滤出来。所创建的这种和 ECM 有相同功用的新型三维“脚手架” ，使干细胞能够在上面生长、繁殖，在加入特定的形态发生素或生长因子后，还使干细胞定向分化。利用我们所创建的这种新颖的三维培养系统培植兔肾干细胞，在精确可控制的生长环境下，加入盐皮质激素醛固酮后发现能成功地分化有功能作用的肾小管，其分化的结构能够维持4 周以上而不崩解。这些独创性工作，首次发现醛固酮能诱导肾小管的发育，不仅在肾的发
7、育生物学基础研究，而且在组织工程领域均作出了独特贡献。3 三维细胞培养的运用3.1 肿瘤生物学三维细胞培养己被广泛运用到肿瘤学研究，在肿瘤的实验性治疗、肿瘤的侵袭性、转移和中心坏死的机制、肿瘤的血管形成和营养供给、体内基因表达的模拟等方面发挥了不可替代的作用。人们观察到，肿瘤细胞不仅能够在普通培养皿上形成单层，还能通过胞间信息传递离开基底面，而向空间发展成三维组织。因此，肿瘤学家专门建立了一套回旋三维培养技术，以研究在没有血管提供营养的情况下，能最大程度产生多少细胞聚集体而又不发生坏死现象。并将肿瘤细胞和来自前列腺或口腔豁膜的上皮细胞进行共培养，观察两种不同的细胞类型是否融合或是不相关地各自生
8、长。另外，利用三维培养还可以有效地测试药物对肿瘤生长和向邻近组织转移的抑制效果。在很多情况下，肿瘤不是由单一细胞类型而是由多种不同类型组成的异原化类群。为了研究周围邻近的健康组织如何受到异原化肿瘤细胞增生行为的影响，常将成纤维细胞，内皮细胞和各种上皮细胞加入到肿瘤组织中，观察肿瘤细胞的侵入和正常细胞生长行为的改变。3.2 软骨和骨组织成熟的软骨细胞和干细胞被广泛用于三维细胞培养，以再生损伤的软骨、骨、韧带、肌键和膝关节半月板。在培养系统中常加入一些生长因子，以刺激分化，产生组织。Spitzer 将兔造骨前体细胞在附有 7. 5 %磷酸三钙(alpha-TCP)的血纤维蛋白内培养 53d，用无
9、alpha-TCP 组作对照，结果显示这种系统能有利于体外骨的形。近来实验也揭示经过成纤维细胞生长因子处理的牛的软骨细胞在三维支架上培养更有利，在细胞的数量、结构、功能等方面都明显优于二维培养。在三维载体上培养骨髓细胞，能够为细胞生长提供最适宜的环境，维持骨髓细胞长期存活。目前函待解决的核心问题是如何理解干细胞在不同生长支架上的发育能力;如何获得具备机械耐受力的细胞外基质;外植体如何和相邻组织最佳整合;复合组织的培育问题。关于复合组织的培育，例如为了体外构建气管，必须使呼吸性上皮组织，透明软骨和平滑肌能够和疏松结缔组织共生。再比如，构建外耳廓时仅仅获得弹性软骨组织是不够的，还必须考虑皮肤和而管
10、的徘应对茸牛书的影响。3.3 循环系统和心脏除了上皮组织和软骨组织外，其它组织都配备有大小各异的血管。如何在成熟的组织中及时产生血管网络是组织工程的重要课题;在治疗领域，所关心的也是如何有目的地改变血管形成，比如，使用血管发生抑制剂封锁住血管内皮生长因子受体( VEGFR 2)从而阻止肿瘤生长和转移。一个十分有用的体外工具是用肿瘤细胞和内皮细胞进行三维辅培养，从而观察血管发生抑制剂对肿瘤血管化的抑制效应。还有报道利用三维培养研究心内膜炎，心肌炎的病理过程。另外，用三维培养研究移植到体内的非细胞形式的心脏瓣膜如何适应周边细胞环境。3.4 神经干细胞从培植单一神经元成为多细胞聚集体，到海马体活标本
11、切片后测试神经元电势，都有使用三维培养的实例。另一个热点是选用神经干细胞取代 Alzheiner 病，Paninson 病或硬化病中损伤的神经组织。为了获得最佳化治疗，首先将神经干细胞培植在三维培养系统中，观察干细胞的戮附行为、在不同培植条件下的发育潜力和它们与毗邻组织的功能整合性。4 三维细胞培养技术的发展前景三维细胞培养技术对于细胞生长、分化以及细胞间相互作用机制的研究具有巨大的意义，同时将会有更多的应用价值被发掘。在支架材料、操作方法和抗肿瘤药物筛选及组织工程应用等方面三维细胞培养基础都取得了一定的成就。但是三维细胞培养技术的发展还面临许多困难，如细胞在三维培养体系中未达到最好的生长状态
12、，与体内的真实情况还有一定的差别几支架材料的选择、辅助的培养方式等不够完善等。相信随着三维细胞培养技术与微流控、微制造、微芯片等前沿技术的融合以及相关学科的发展，这些问题将会逐一解决。三维细胞培养技术在肿瘤学、干细胞生物学、组织形成、血管发育、器官再造等领域的应用将会取得巨大的成就，是目前值得深入研究的课题。【参考文献】1胡康洪,姚颖. 三维细胞培养技术的研究与应用J. 医学分子生物学杂志,2008,02:185-188.2滕伟,郭志坤. 细胞三维培养的研究进展J. 医学综述,2008,12:1767-1770.3Hiroshi Kikuchi,Keiko Suzuki,Nobuhiro Sa
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