1、细胞因子( Cytokine, ck) 是由多种细胞，特别是免疫细胞所产生、具有广泛生物学活性的小分子量蛋白（分子量约880kDa） 。,细胞因子概念,细胞因子的分类,按产生CK的细胞类型分类,细胞因子的分类,按产生CK的功能分类,1.白细胞介素(interleukin, IL) 2.集落刺激因子（colony stimulating factor, CSF).3.干扰素（interferon, IFN)4.肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor, TNF)5.趋化因子（chemokine) 6.生长因子(growth factor, GF),白细胞介素,白细胞介素，简称白介
2、素，是指 介导白细胞或其他细胞间相互作用的细胞因子。,白细胞介素(interleukin, IL),主要由单核巨噬细胞、T淋巴细胞等所分泌；介导并调节固有免疫、适应性免疫，在炎症反应中起重要作用。目前已发现35种以上。,重要的细胞因子介绍 (IL-1,IL-2),1972年Gery等发现人白细胞培养的上清中含有一种可溶性物质，这种物质可促进小鼠胸腺细胞对植物血凝素(PHA)的有丝分裂反应。 起初命名为淋巴细胞激活因子(lymphocyte-activating factor, LAF)或内源性热原质(endogenous pyrogen) 等，1979年国际统一命名为IL-1。,白细胞介素(i
3、nterleukin, IL),IL-1,巨噬细胞,IL-1,诱导吞噬细胞活化,引起炎症及发热,白细胞介素(interleukin, IL),IL-1,1976年Morgan等，发现小鼠脾细胞培养上清中含有一种刺激胸腺细胞生长的因子，由于这种因子能促进和维持T细胞长期培养，称为T细胞生长因子（T cell growth factor,TCGF)， 1979年统一命名为白细胞介素2 （interleukin 2,IL-2)。,白细胞介素(interleukin, IL),IL-2,白细胞介素(interleukin, IL),IL-2,集落刺激因子,是一组在体内外均可选择性刺激造血祖细胞增殖、分
4、化并在半固体培养基上形成细胞集落（colony）的细胞因子。,集落刺激因子(Colony stimulating factor, CSF),巨噬细胞-粒细胞集落刺激因子（GM-CSF）巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF）粒细胞集落刺激因子（G-CSF）,另外，红细胞生成素（EPO），干细胞生长因子（SCF）和血小板生成素（TPO）也视为CSF家族成员。,集落刺激因子(Colony stimulating factor, CSF),干扰素,干扰素是一组具有干扰病毒感染和复制能力的细胞因子。主要包括I型(IFN, IFN等)和 II型(IFN),干扰素(Interferon， IFN),I 型干扰素
5、：,II型干扰素:,CD8+T细胞、 CD4 + T细胞、NK细胞,受病毒感染的细胞,抗病毒作用,免疫调节作用,IFN- a的抗病毒作用,病毒,病毒复制,诱导刺激,胞核,抑制病 毒复制,干扰素(Interferon， IFN),干扰素(Interferon， IFN),IFN-的生物学效应,肿瘤坏死因子,此因子由于其在体内外均可直接杀伤肿瘤细胞而得名。,肿瘤坏死因子(Tumor necrosis factor，TNF),肿瘤坏死因子是一类直接导致肿瘤发生出血坏死，并具有免疫调节活性的蛋白质。,TNF-a 157 aa,活化的T细胞,分为:,TNF-a,TNF-b 淋巴毒素(lymphotoxi
6、n- a, LT- a),TNF-b （LTa ）171 aa,活化的巨噬细胞,同源性28%相同的受体相同的生物学效应,上调细胞因子产生水平（IL-2，IL-4， g -IFN，CSF），上调 IL-2 受体的表达,TNF-a,诱导分化 上调抗体 产生细胞数量,上调前列腺素产生水平，上 调细胞因子产生水平（IL-1，IL-6，IL-8，GM-CSF）,趋化并活化中性粒细胞,体内刺激产生CSF 上调造血功能,肿瘤坏死因子(Tumor necrosis factor，TNF),TNF-a 的生物学效应,生长因子,生长因子是一类可介导不同类型细胞生长和分化的细胞因子。根据其功能和作用的靶细胞不同，分
7、别命名为：,生长因子(Growth factor，GF),1、转化生长因子（transforming growth factor- TGF- ）；2、神经生长因子(nerve growth factor,NGF) ;3、表皮生长因子(epithelial growth factor,EGF); 4、成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factor,FGF); 5、血小板生长因子（platelet-derived growth factor,PDGF）6、血管内皮细胞生长因子（vascular endothelial cell growth factor,VEGF),趋化因子
8、,趋化因子是一类对不同靶细胞具有趋化效应的细胞因子家族。该家族成员依据其分子氨基端半胱氨酸（Cys）的数目及其间隔，可分为不同的亚家族：,趋化因子（Chemokine）,亚家族 ：Cys-X-Cys （X代表任意氨基酸残基），如IL-8趋化中性粒细胞；亚家族： Cys-Cys，如单核细胞趋化蛋白，趋化单核细胞；亚家族： Cys，如淋巴细胞趋化蛋白，趋化淋巴细胞。 亚家族： Cys-X3-Cys， Fractalkine，可趋化单核细胞、NK细胞,趋化因子的结构,N端序列 ：与其受体结合,C端a 螺旋 ：传导信号,趋化因子的结构,自分泌 autocrine,内分泌 endocrine,旁分泌 p
9、aracrine,1、作用方式（ action manners ）：,细胞因子作用的共同特点,IL-4,2、多效性 （Pleiotropy） ：,5.拮抗性（Antagonism）：,3.重叠性（Redundancy）：,4. 协同性（synergy）：,细胞因子的合成和分泌过程是一种自我调控的过程，正常条件下，细胞因子极少储存，适当刺激后迅速合成、迅速释放、迅速发挥作用、迅速降解。,6、迅速（Rapidity ）,7、高效性（ high potency）,极微量的细胞因子（pM,10-12 M)就可发挥显著的生物学效应。细胞因子与其受体高亲和力结合，使细胞因子的生物学作用具有高效性。在体内p
10、M水平即可显示明显的生物学效应。例如：1pg的干扰素能保护100万个细胞抵御1000万病毒颗粒的感染,细胞因子以非特异性方式发挥作用，且不受MHC限制。,8、非特异性（Non-specificity）,细胞因子受体,细胞因子作用的发挥依赖于细胞表面的受体。细胞因子和相应受体结合可以传导细胞信号，使细胞活化、增殖。,细胞因子受体主要表达于细胞表面，但某些情况下，如强免疫原性物质刺激，许多种类的细胞因子受体可以从膜表面脱落，成为可溶性分子。可与膜型受体竞争，从而负向调节相应细胞因子的生物学作用。,-S-S-,-S-S-,-S-S-,CC C C,C1C3C2,C1C3C2,C1C3C2,C1C3C
11、2,G 蛋白,免疫球蛋白超家族受体,I类细胞因子受体,II类细胞因子受体,TNF-R,趋化因子受体,IL-1 M-CSF C-kit,IL-2 IL-3 IL-4 IL-5 IL-6 IL-7,IL-9 IL-11 IL-12 IL-13 IL-15 OSM,GM-CSF G-CSF LIF CNTF 生长激素催乳素,IFN-a IFN-b IFN-g,TNF-a TNF-b CD40 神经生长因子（NGF） FAS,IL-8 RANTES MIP-1 PF4 MCAF NAP-2,细胞因子受体根据其胞外结构及氨基酸序列的相似性分为5个家族。,细胞因子受体,细胞因子的主要生物学效应,介导天然免
12、疫和炎症反应介导和调节特异性免疫应答决定免疫应答的类型参与造血,介导天然免疫和炎症反应,多种细胞因子参与天然免疫和炎症反应的启动及其效应。其中，IL-6、IL-1、IFN、TNF和趋化因子家族是启动抗菌性炎症反应的关键因子，被称为促炎因子。,细胞因子的主要生物学效应,介导天然免疫和炎症反应,细胞因子的主要生物学效应,介导天然免疫和炎症反应,IL-1、6 活化淋巴细胞、NK细胞,TNF- a 增加血管通透性,在炎症早期IL-6、IL-1、TNF还可促进肝脏产生急性期蛋白，增强机体抵御致病微生物的侵袭。,肝脏,TNF-a, IL-1, IL-6,血清淀粉样蛋白,C反应蛋白,纤维蛋白原,甘露聚糖结合
13、凝集素,细胞因子诱导急性期蛋白合成,细胞因子的主要生物学效应,介导天然免疫和炎症反应,干扰素可抑制病毒在体内复制并抗病毒感染；IL-14、IL-12等可分别促进NK细胞增殖及其胞毒作用；IFN-、TNF等可激活巨噬细胞，并促进其吞噬和杀伤作用。,细胞因子的主要生物学效应,介导天然免疫和炎症反应,细胞因子在机体抗感染的天然免疫机制中发挥重要的作用。,介导和调节特异性免疫应答,趋化因子可诱导不同免疫细胞的定向运动，并参与其激活等。,细胞因子的主要生物学效应,介导和调节特异性免疫应答,在免疫应答的全过程，不同类型细胞因子在不同环节分别发挥重要作用。,IFN可诱导抗原递呈细胞表达MHC分子，促进抗原递
14、呈；,IL-2、IL-4、IL-5、IL-6等可促进T（B）细胞的增殖、分化；,决定免疫应答的类型,近年来发现同一类免疫细胞可按其分泌的细胞因子而分为不同亚群，其意义在于机体免疫应答类型在相当程度上取决于免疫细胞产生的细胞因子谱。,细胞因子的主要生物学效应,决定免疫应答的类型,Th1细胞产生IL-2、IFN- 、TNF- 等参与细胞介导的炎症反应；,细胞因子的主要生物学效应,决定免疫应答的类型,Th2细胞主要产生IL-4、IL-5、IL-6、IL-9、IL-10、IL-13等主要介导体液免疫应答和I型超敏反应。,参与造血,细胞因子的主要生物学效应,参与造血,细胞因子与临床,细胞因子与疾病的发生
15、,细菌内毒素性休克 ：TNF-、IL-1等细胞因子过度表达,免疫缺陷病：细胞因子及其受体的缺陷，如IL-2或IL-2受体缺陷或突变可导致重症联合免疫缺陷病,自身免疫病：IFN-可诱导某些自身组织细胞表达MHC-II类抗原，从而使这些细胞将自身抗原递呈给自身反应性T细胞，导致自身免疫性疾病,超敏反应：IL-4、 IL-5可正向调控IgE的合成，从而在I型超敏反应的发生密切相关,细胞因子补充和添加疗法 : 通过各种途径使患者体内细胞因子水平增加，充分发挥细胞因子的生物学作用，从而抗御和治疗疾病。,细胞因子与临床,细胞因子与治疗,细胞因子阻断和拮抗疗法：其基本原理是抑制细胞因子的产生和阻断细胞因子与
16、其相应受体的结合及受体后信号传导过程，使细胞因子的病理性作用难以发挥。感染性休克等的治疗。例如抗TNF单克隆抗体可以减轻甚至阻断感染性休克的发生，IL-1受体拮抗剂对于炎症、自身免疫性疾病等具有较好的治疗效果。该疗法适用于自身免疫性病、移植排序反应.,细胞因子与临床,细胞因子与治疗,可溶性细胞因子受体作为拮抗剂,effects,N,C,5,3,DNA,Protein,细胞因子受体的克隆,5,3,DNA,PCR,可溶性细胞因子受体,细胞因子受体的突变,Receptor blocker (as a receptor antagonist),已批准上市的细胞因子基因工程药物,正进行临床试验的细胞因子
17、基因工程药物,体内效果远不如在体外理想体内应用毒性反应相当严重细胞因子的半衰期过短（以分钟计）,细胞因子与临床,细胞因子临床治疗中存在的问题,细胞因子的局部应用诱导机体持续产生内源性细胞因子细胞因子导向疗法改进细胞因子在体内的应用方案联合应用优于单独用细胞因子基因疗法,细胞因子与临床,细胞因子疗法，需加以改进,新细胞因子的基因克隆化,从人类基因组发现新细胞因子,后基因组时代的“捞鱼”,(1). 传统的细胞因子克隆化策略活性筛选 发现免疫分子的活性线索 免疫分子表达细胞 提取mRNA 逆转录成为cDNA 克隆化至真核表达载体 转化宿主细胞 免疫分子活性筛选 鉴定,例1：IL-3的发现（Cell
18、1986， 47：3，）,猴T细胞系UCD-144MLA,CML细胞,刺激增殖,提取mRNA,构建的cDNA 表达文库,含30000个克隆,提取质粒DNA,分成100份，每份200个克隆,分别转染,COS-7细胞,测定上清刺激活性,8份具有活性,抗GM-CSF抗体抑制实验,只有1份不被抑制,进一步有限稀释法筛选,获得猴IL-3 cDNA,杂交筛选人的基因文库,获得人IL-3 序列,cDNA libraries,根据N端序列筛选 发现免疫分子的活性线索免疫分子表达细胞 大批量提取活性蛋白N端氨基酸序列分析推断核苷酸序列合成寡核苷酸探针或引物RT-PCR或杂交筛选免疫分子cDNA文库 鉴定,例：I
19、L-15 （Science 1994，264：965）,猴肾上皮细胞系CV-1/EBNA,培养上清,刺激,不被IL-2抗体所抑制,纯化,测定N端33个氨基酸序列,合成引物,推测两端DNA序列,N,C,5,3,扩增92bp cDNA做为探针,筛选原始文库,获猴IL-15阳性克隆,筛选人cDNA文库,获得人IL-15,（PCR）,细胞因子和受体相互关系的研究,利用酵母双杂交系统研究蛋白与蛋白相互关系,酵母,A,B,C,酵母双杂交系统的建立基于“真核生物调控转录起始”。,酵母双杂交系统的建立与发展,酵母双杂交系统的建立基于“真核生物调控转录起始”。,酵母转录子Gal4分子由一条多肽链组成，含有881
20、个氨基酸。它有两个结构域：1、 DNA结合结构域（DNA binding domain, DB ）由位于 N-末端1147个氨基酸构成，能识别位于Gal 1基因的上游激活序列（UAS, upstream activating sequence）,此外， 在其N-端还具有一段核定位序列；2、转录激活结构域（activation domain, AD）由位于C-末端的768881位氨基酸构成。 当Gal4 的两个结构域位于不同肽链上，只要它们在空间上充分接近，则能够恢复Gal4作为转录因子的活性.,酵母转录子Gal4分子,激活转录,Fields等人的工作标志双杂交系统的正式建立,他们以与调控SUC
21、2基因有关的两个蛋白质Snf1和Snf2为模型， 将前者与Ga14的DB结构域融合，另一个与Ga14的AD结构域的酸性区域结合。（形成融合蛋白）,Snf1,Snf2,Ga14的DB,Ga14的AD,诱饵(bait),猎物或靶蛋白(prey or target protein),如果Snf1和Snf2之间存在相互作用，那么分别位于这两个融合蛋白上的DB和AD就能重新形成有活性的转录激活因子，从而激活相应基因的转录与表达。,这个被激活的、能显示“诱饵”和“猎物”相互作用的基因称为报道基因（reporter gene）,X,Y,Ga14的DB,Ga14的AD,诱饵(bait),猎物(prey),报道基因,表达,报道基因的基因产物,通过对报道基因表达产物的检测，反过来可判别作为“诱饵”和“猎物”的两个蛋白之间是否可存在相互作用。,K,Ga14的DB,融合蛋白,表达融合蛋白的载体,URA3,转化酵母菌,URA3,同时转化了细胞因子（已知）和 细胞因子的受体（未知）融合表达载体的酵母细胞才有-半乳糖苷酶的活性，单独转化其中任何一个载体都不能检测出-半乳糖苷酶的活性。,表达-半乳糖苷酶,Thank you !,
