1、手足口病标本采集及检测技术方案,2014年版,目录,病原学,手足口病（hand, foot and month disease, HFMD）是由肠道病毒引起的急性传染病，多发于10岁以下婴幼儿，以手、足、口腔等部位皮肤黏膜的皮疹、疱疹、溃疡为典型表现，个别患者可出现心肌炎、肺水肿、无菌性脑脊髓膜炎、脑炎等并发症。手足口病并不是一种新发传染病，自1957年首次报道以来，曾在许多国家和地区多次流行。2006年世界卫生组织公布该病在须申报疾病的发病率中居第四位。该病全年皆可发生，我国以夏秋季多发，是可防、可治且预后较好的小儿常见传染病。中华人民共和国卫生部于2008年5月2日起，将该病列为丙类传染病
2、管理。,背景知识,病原学,引起手足口病（HFMD）的病毒属于小RNA病毒科肠道病毒属，包括： 柯萨奇病毒 A组（Coxasckievirus A, CVA）的 2、4、5、7、9、10、16 型等 B组（Coxasckievirus B, CVB)的1、2、3、4、5 型等； 肠道病毒71型（Human Enterovirus 71, EV71）； 埃可病毒（Echovirus, ECHO）等。,背景知识,病原学,其中以EV71和CVA16为主要病原。近年来我国陆续出现这两种病原引起的HFMD季节性流行，局部呈强流行态势。由此，HFMD的有关研究日益受到人们的重视。 目前对于HFMD感染尚没有
3、特效的疫苗和药物，主要采用对症和支持治疗，积极防止发生并发症，因此加强疾病及病原的监测、准确处置疫情、开展健康教育是控制的关键。,背景知识,国外流行概况,手足口病是一种全球性传染病，世界大部分国家和地区均有此病流行的报道。 1957年首先发生于加拿大，并于同年在新西兰被最早加以描述和报告。 1958年加拿大初步查出CVA16病毒为本病病原。澳大利亚、美国、瑞典是最早出现手足口病的国家之一。 1959年英国伯明翰、美国加利福尼亚地区发生流行，并从患者疱疹液中分离出CVA16，并根据本病病变分布特点，被正式命名为“手足口病” 。,国外流行概况,1972年EV71病毒引起的手足口病在美国被首次确认，
4、此后EV71感染与CVA16感染交替出现，成为手足口病的主要病原体。 日本是手足口病发病较多的国家，历史上发生过多次CVA16，EV71引起的大规模流行。,我国流行概况,1981年我国首次在上海市暴发手足口病。此后，北京、河北、天津、福建、吉林、山东、湖北、青海、广东和河南等省市陆续出现该病报道。 1983年天津发生由CVA16引起的手足口病暴发流行，510月间发生病例7000余例，经过两年散发流行后，1986年出现了以托儿所及幼儿园为主的疫情暴发。 1995年武汉病毒研究所从手足口患儿标本中分离到EV71。 1998年深圳市防疫站同样分离到EV71。,我国流行概况,1998年我国台湾地区发生
5、EV71感染引起的手足口病和疱疹性咽峡炎流行，检测哨点共报告129106例患者，重症患者405例，死亡78例，多为五岁以下幼儿。 2000年山东省招远市手足口病暴发，市人民医院共接诊患儿1698例，最小年龄5个月，最大14岁，3例合并心肌炎死亡。 2008年安徽阜阳市发生较大规模手足口病疫情，共报告病例6606例，其中23例死亡 。,一、采集标本的种类、保存和运输,（一）粪便标本,采集病人发病3日内的粪便标本，用于病原检测。粪便标本采集量5-8g/份，采集后立即放入无菌采便管内，外表贴上带有唯一识别号码的标签， 4暂存12小时内送达实验室； -20以下低温冷冻保藏； 长期保存的标本存于-70冰
6、箱。,一、采集标本的种类、保存和运输,（二）咽拭子标本,采集病人发病3日内的咽拭子标本，用于病原检测。用专用采样棉签，适度用力拭抹咽后壁和两侧扁桃体部位，应避免触及舌部；迅速将棉签放入装有3-5ml保存液（含5%牛血清维持液或生理盐水，推荐使用维持液）的15ml外螺旋盖采样管中，在靠近顶端处折断棉签杆，旋紧管盖并密封，以防干燥，外表贴上带有唯一识别号码的标签。 4暂存并在12小时内送达实验室， -20以下低温冷冻保藏， 需长期保存的标本存于-70冰箱。,一、采集标本的种类、保存和运输,（三）血清标本,在手足口病流行年份中应采集EV71 和CVA16感染的手足口病患儿的双份血清。采集急性期（发病
7、0-7d）和恢复期（发病14-30d）双份配对血清用于阐明和分析EV71和CVA16感染后IgG和IgM抗体的动态变化，评价血清学抗体试剂盒的敏感性和特异性。静脉采集3-5ml全血，置于真空无菌采血管中，自凝后，分离血清，将血清移到2ml外螺旋的血清保存管中，外表贴上带有唯一识别号码的标签。将血清置于-20以下冰箱中冷冻保存。,一、采集标本的种类、保存和运输,（四）疱疹液,在手足口病的实验室诊断中，从疱疹液中分离到病毒即可确诊该病毒为病因，可同时采集多个疱疹作为一份标本。先用75%的酒精对疱疹周围的皮肤进行消毒，然后用消毒针将疱疹挑破用棉签蘸取疱疹液，迅速将棉签放入内装有3-5ml保存液（含5
8、%牛血清维持液或生理盐水，推荐使用维持液）的采样管中，在靠近顶端处折断棉签杆，旋紧管盖并密封，采样管外表贴上带有唯一识别号码的标签。所采集标本4暂存立即（12h内）送达实验室，20以下低温冷冻保藏，需长期保存的标本存于70冰箱。,一、采集标本的种类、保存和运输,（五）肛拭子标本,采集病人发病3日内的肛拭子标本，用于病原检测。用专用采样棉签，从患儿肛门轻轻插入，适度用力弧型左右擦拭数下，拔出后,迅速将棉签放入装有35ml保存液（含5%牛血清细胞维持液）的15ml外螺旋的采样管中，在靠近顶端处折断棉签杆，旋紧管盖，并密封，以防干燥。采样管外表贴上带有唯一识别号码的标签。,一、采集标本的种类、保存和
9、运输,（六）尸检标本,采集脑、肺和肠淋巴结等重要组织标本，每一采集部位分别使用单独的消毒器械。每种组织应多部位取材，每部位应取2-3份约5-10g的组织，淋巴结2个，分别置于15ml-50ml无菌的有外螺旋盖的冻存管中，采样管外表贴上带有唯一识别号码的标签。,一、采集标本的种类、保存和运输,（七）脑脊液标本,出现神经系统症状的病例，可采集脑脊液标本，进行病毒分离或核酸检测。采集时间为出现神经系统症状后3天内，采集量为1.0-2.0ml。采集后立即装入无菌带垫圈的冻存管中，4暂存立即(12h内)送达实验室，20以下低温冷冻保藏，需长期保存的标本存于70冰箱。但EV71感染神经系统时，很难在脑脊液
10、中检测到EV71病原。,一、采集标本的种类、保存和运输,一、采集标本的种类、保存和运输,临床标本在运输和贮存过程中要避免反复冻融。标本采集后要全程冷藏或冷冻保存和运输，12小时内送达实验室。依照人间传染的病原微生物名录，肠道病毒或潜在含有肠道病毒的标本按B类包装，置于冷藏保存盒内运输，尽量缩短运输时间。可采用陆路或航空等多种运输方式，但在运输过程中应采取保护措施，避免强烈震动、重力挤压等现象。在送到省、地、市级CDC实验室时，包装盒内应带冰且包装完整。在上送标本的同时，需附带相关的手足口病病例临床标本采样登记表。,二、标本采集注意事项,在手足口病的实验室诊断中，从疱疹液或脑脊液中分离到病毒即可
11、诊断该病毒为病因。,标本保存液的配置,三、实验室检测操作流程,（一）病毒分离,三、实验室检测操作流程,（一）病毒分离,1.试剂配置（1）细胞的生长液、维持液的配制见下表：,三、实验室检测操作流程,（一）病毒分离,（2）粪便标本和肛拭子的处理液 完全PBS液中加入P.S溶液，终浓度为青霉素100单位/ml，链霉素为100g/ ml。 完全PBS液的配置：取以下1份B液和1份C液加到8份A液中即为完全PBS工作液。,三、实验室检测操作流程,（一）病毒分离,用600800ml蒸馏水溶解以上盐类，加蒸馏水补至1000ml，10psi（70Kpa）15分钟高压灭菌，即为不完全PBS工作液（不含钙、镁离子
12、）。,A液：,三、实验室检测操作流程,（一）病毒分离,B液：,溶解于100ml蒸馏水中，10psi（70Kpa）15分钟高压灭菌。,C液：,溶解于100ml蒸馏水中，10psi（70Kpa）15分钟高压灭菌。,三、实验室检测操作流程,（一）病毒分离,2病毒分离细胞系 许多细胞系可支持人肠道病毒（如EV71、CVA16）生长。 对于检测手足口病的病原来说，建议所有怀疑含EV71、CVA16等肠道病毒感染的标本均需接种到以下两种细胞系： RD细胞，来源于人横纹肌肉瘤细胞。 HEp-2细胞，来源于人喉癌上皮细胞。,三、实验室检测操作流程,（一）病毒分离,3标本的处理（1）粪便标本和肛拭子的处理操作步
13、骤： 1）在离心管上标记标本号； 2）每管中加入10ml PBS、1g玻璃珠、1ml氯仿； 3）在生物安全柜中将每一份粪便标本取大约2g加入标记好的离心管中（确保离心管上的标号与原始标本的标号一致）；肛拭子为2ml； 4）剩余的原始标本最好留在原容器中，冻存于20；,三、实验室检测操作流程,（一）病毒分离,5）确保拧紧离心管，用机械震荡器剧烈震荡20min； 6）在确保离心机的盖子盖好和离心桶密封的情况下，用冷冻离心机在1500g条件下离心20min； 7）在生物安全柜中将每1份标本的上清液分别吸入2个有外螺旋盖的冻存管中（如果上清液不清澈，应再用氯仿处理1次）； 8） 1管粪便悬液冻存于20
14、作为备份，另1管存于4-8以备接种。,三、实验室检测操作流程,（一）病毒分离,（2）疱疹液标本的处理 疱疹液标本通常直接用于RNA提取或病毒分离。（3）脑脊液标本的处理 脑脊液标本通常直接用于病毒分离。（4）咽拭子标本的处理 咽拭子要在标本运输（保存）液中充分搅动（至少40下），以洗下拭子上粘附的病毒及含有病毒的细胞等，用于病毒分离时，需要冻融一次（防止多次冻融），使细胞破裂，释放病毒颗粒。然后在4条件下，10000 rpm离心20min，用上清接种到细胞上或直接提取RNA。如果发现有细菌污染，须用滤器过滤除菌。,三、实验室检测操作流程,（一）病毒分离,4接种和观察（病毒分离） （1）通常使用
15、ml的斜面试管培养细胞，传细胞时，每管加细胞培养液1.5ml。显微镜下观察单层细胞，以确保细胞是健康、无污染的。一个健康的单层细胞会在传代后48小时左右形成； （2）倒掉生长液（GM），换上1-1.2ml的维持液（MM）； （3）每一份标本需要同时接种2支RD细胞和2支HEp-2细胞，正确标记每支细胞培养管（包括标本的编号、日期、传代数）； （4）每一种细胞至少标记一管作为阴性对照；,三、实验室检测操作流程,（一）病毒分离,（5）每支试管接种0.2ml的标本悬液，培养温度要求36。 （或者使用吸附的方法接种病毒：接种标本前，倒掉生长液（GM），每支试管接种0.2ml的标本悬液，培养温度为36；
16、吸附1小时后，换上1.5ml的维持液（MM）。同样每份标本需同时接种2支RD细胞和2支HEp-2细胞）。（6）使用倒置显微镜每天观察细胞培养管，以观察有特征性的肠道病毒致细胞病变效应（CPE）的出现（如细胞变圆，折光增强并脱离管壁等）；,三、实验室检测操作流程,（一）病毒分离,（7）记录接种管和对照管细胞所发生的变化至少一周，记录CPE（1+4+）、提示细胞受毒性反应、老化或污染的影响而发生的变化（1+， Ct值35.0的样本为临界值。Ct值38.0的样本或无数值的标本为阴性。,三、实验室检测操作流程,(四) Real-time RT-PCR （rRT-PCR）,（2） One Step Re
17、al-time PCR法同时检测EV71和CVA16核酸（双通道检测）双通道可以同时检测EV71和CVA16核酸,在提取核酸后短时间(2.5小时)内检测到标本中是否含EV71或CVA16核酸。反应体系配置反应体系共25l，模板量可根据样本情况自行决定（临床标本通常使用5l模板量），不够部分以水补足。如选用另外试剂盒，反应体系及条件随之变化。,三、实验室检测操作流程,(四) Real-time RT-PCR （rRT-PCR）,a.先将试剂解冻，从试剂盒中取出相应的试剂，反应液在室温融化后，瞬时离心，按n+1配置25l反应体系（n=样本数+1管阳性对照+1管阴性对照），每个测量反应体系配置如下表：b.将下述反应液混匀离心后，按照每管20L分装于适用的PCR管中。,三、实验室检测操作流程,
