1、第三章 病毒感染的诊断与防治,吉林大学 基础医学院病原生物学教研室,常用的病毒学诊断方法包括：病毒的分离鉴定病毒的血清学检查病毒蛋白和核酸的检测,第一节 病毒感染的诊断,一、标本的采取与送检,应注意下列原则：1.对本身带有杂菌 (如咽拭子、粪便) 或易受污染的标本，要进行病毒分离培养时，应使用抗生素。 2.因病毒在室温中易失去活性，标本应低温保存并尽快送检。 3.血清学诊断标本的采取应在发病初期和病后23w内各取1份血清，以便对比双份血清抗体效价的动态变化。,二、病毒的分离与鉴定,(一) 病毒的分离1.动物接种 是最原始的病毒培养方法，根据病毒种类不同，选择敏感动物及适宜接种部位，如嗜 神经性
2、病毒（狂犬病毒）可接种于小鼠脑内，痘病毒可接种于家兔角膜或皮内。,2.鸡胚培养 鸡胚对多种病毒敏感。一般采用孵化914天的鸡胚，根据病毒种类不同，将病毒标本 接种于鸡胚的不同部位，最常用的鸡胚接种部位有：羊膜腔、尿囊腔、绒毛尿囊膜和卵黄囊等。,3.组织培养法 (tissueculture) 或细胞培养 (cellculture)法 是将离体活组织块或分散的组织细胞加以培养的技术总称，为病毒分离鉴定中的最常用的基本方法。,细胞的变化有些病毒在细胞内增殖时可引起特有的细胞病变，称为细胞病变效应 (CPE)。常见的变化有细胞变圆、聚集、坏死、溶解或脱落等。有些病毒如麻疹病毒、CMV、RSV等 作用于
3、细胞膜，可使邻近的细胞相互融合，形成多核巨细胞或称融合细胞。 有些病毒 (如狂犬病病毒、麻疹病毒等) 可在培养细胞中形成胞浆或核内的包涵体。,病毒在培养细胞中增殖的指标,病毒培养时出现的CPE,2.红细胞吸附 (hemadsorption,HAd) 流感或副流感病毒等感染细胞后，由于细胞膜上出现了血凝素(haemagglutinin,HA)，具有吸附脊椎动物 (豚鼠、鸡、猴等) 红细胞的能力，这一现象称红细胞吸附，常用来测定具有HA的粘病毒与副粘病毒的增殖。若有相应的抗血清，则能中和细胞膜上的HA，HAd不再发生，称红细胞吸附抑制试验。,3.干扰现象(interference) 某些病毒感染细
4、胞时不出现CPE或其他易于测出的变化(如HAd)，但能干扰在其后感染的另一病毒的增殖。如风疹病毒感染Vero细胞时CPE不明显，但它能干扰后感染的埃可病毒 (ECHOV) 的增殖，从而阻抑后者所特有的CPE。,4.细胞代谢的改变 病毒感染细胞的结果可使培养液的pH值改变，说明细胞的代谢在病毒感染后发生了变化。这种培养环境的生化改变也可作为判断病毒增殖的指标。,(二) 病毒的数量与感染性测定,1.蚀斑测定 是一种检查和准确滴定病毒感染性的方法。将稀释的病毒悬液加入单层细胞培养瓶中。病毒吸附后，再覆盖一层融化的半固体营养琼脂，使病毒在单层细胞培养中有限扩散。结果是每一个有感染性的病毒在单层细胞中可
5、产生一个局限性的感染灶。用活性染料 (如中性红) 染色，则活细胞着色，受病毒感染而破坏的细胞不着色，形成肉眼可见的蚀斑(plaque)。每个蚀斑是由一个感染性病毒颗粒形成的，称作蚀斑形成单位 (plaque forming unit,PFU)。病毒悬液中的感染性病毒量的滴度可用PFUml表示。,2.50%组织细胞感染量 (TCID50)测定法 该方法是测定病毒能使50%的组织培养细胞发生感染的最小量。一般是将病毒悬液作10倍的系列稀释，分别接种细胞，经一定时间后观察CPE、血细胞吸附等指标，以最高稀释度能感染50%细胞的量为终点。最后用统计方法计算出50%组织细胞感染量（ 50%tissue
6、culture infectious dose,TCID50)。,三、病毒感染的血清学诊断,原理是用已知病毒抗原来检测病人血清中有无相应抗体，故须待病人感染后体内产生抗体时才能检出。 另外，在采取临床标本及病人血清应注意病程，必须采取患者急性期血清与恢复期血清 (双份血清) 进行血清学试验。若第2次血清抗体滴度比第1次高出4倍以上时，才有诊断意义。,1.中和试验(neutralizing test,NT test),是病毒在活体内或细胞培养中被特异性抗体中和而失去感染性的一种试验。 中和抗体(netralizing antibodies,NTAb)是作用于病毒表面抗原 (衣壳或包膜) 的抗体，
7、同种不同型病毒间一般无交叉，特异性高，而且抗体在体内维持时间长。中和抗体阳性不一定表示正在感染中，也可能因以前有过隐性感染所致。因此，中和试验适用于人群免疫情况的调查，在临床诊断上较少使用。,2.补体结合试验 (complement fixation test,CF test),用已知病毒可溶性(CF)抗原来检测病人血清中相应(CF)抗体。CF抗原是病毒的内部抗原，同种异型间常有交叉，故特异性较中和试验低。但CF抗体出现较早，消失较快，故CF阳性可作为近期感染的指标。,3.血凝抑制试验(hemagglutinatia inhibition test, HI test),具有HA的病毒能凝集鸡、
8、豚鼠、人等的红细胞，称血凝现象。这种现象能被相应抗体抑制，称HI试验。其原理是相应抗体与病毒结合后，阻抑了病毒表面的HA与红细胞的结合。本试验简易、经济，特异性高，常用于粘病毒及乙型脑炎病毒感染的辅助诊断及流行病学调查，也可鉴定病毒的型与亚型。,病毒 +鸡RBC = 凝集（血凝试验）病毒 +特异性抗体 +鸡RBC=不凝集 （血凝抑制试验）,四、病毒感染的快速诊断,快速诊断主要是指从含有病毒标本及感染机体的血清中检测病毒颗粒、蛋白抗原、IgM抗体和核酸等，往往在数小时内即可得出结果。,(一) 形态学检查,1.电镜和免疫电镜检查 2.普通光学显微镜检查 有些病毒在宿主细胞内增殖后，在细胞的一定部位
9、(胞核、胞浆或两者兼有) 出现一个或数个、圆形或椭圆形、嗜酸性或嗜碱性的结构，即包涵体。包涵体对病毒感染的诊断有一定价值。,(二)病毒蛋白抗原检查,用荧光素、放射性同位素、过氧化物酶等标记抗体，采用免疫学和分子生物学技术，检测标本中的病毒蛋白抗原，具有敏感、特异、快速等优点。1.免疫荧光技术 (immunofluorescence,IF) 2.固相放射免疫测定 (solid-phase radioimmunoassay,SPRIA) 3.酶免疫技术 (enzyme immunoassay,EIA)此法可检测多种病毒及其抗体，主要是酶免疫组化法和酶联免疫吸附试验法(ELISA)。,(三)特异性I
10、gM抗体的检测,检测病毒特异性IgM抗体可诊断急性感染，特别是对证实孕妇感染风疹病毒尤为重要，但应注意类风湿因子 (IgM) 的干扰。另外，检测早期抗原的抗体是快速诊断的另一途径。如检测针对EBV的早期抗原(EA)、核心抗原 (EANA) 和衣壳抗原 (VCA) 等的抗体，可以区别急性或慢性EBV感染。此外，分子生物学检测技术、气相色谱技术等，均可用来分析和鉴定病毒感染。,(四) 检测病毒核酸,1.核酸杂交技术 用于病毒检测的有斑点杂交、细胞内原位杂交 、DNA印迹杂交、RNA印迹杂交等。2.核酸扩增法 目前多数病毒基因已通过分子克隆技术被明确了核苷酸序列，使得DNA扩增技术逐步发展为常规诊断
11、技术之一。3.基因芯片技术,基因芯片,又称DNA芯片、生物芯片（biochip）。 其原理是：将已知的生物分子探针或基因探针，大规模或有序排布于小块硅片等载体上，与待测样品中的生物分子或基因序列相互作用和并行反应，在激光的激发下，产生的荧光谱信号被接受器收集，计算机自动分析处理数据并报告结果。其优点是：可以一次性完成大量样品DNA序列的检测和分析，解决了传统核酸杂交技术的许多不足。芯片技术在病毒等微生物学诊断和流行病学调查方面有着广阔的应用前景。,第二节 病毒感染的预防,一、人工自动免疫(一)活疫苗(attenuated vaccine,or living vaccine)1.常规活疫苗即减毒
12、活疫苗(attenuated vaccine)，通常是用自然或人工选择法(如温度敏感株) 筛选的对人低毒或无毒的变异株制成的疫苗，如脊髓灰质炎、流感、麻疹的减毒活疫苗等。,2.新型活疫苗 应用基因工程技术，控制病毒变异，或利用DNA重组技术，插入和定向缺失病毒基因，将保护性病毒蛋白的编码基因插入活载体中或选择性地去除病毒的某一个或几个致病基因而达到减毒作用制备的可在机体内增殖，诱发抗病毒免疫应答的疫苗。,(二)死疫苗(killed vaccine),1.灭活全病毒疫苗 应用物理或化学方法使病毒完全灭活而制成的疫苗。常用的有乙型脑炎、狂犬病、流感等灭活疫苗。 2.亚单位疫苗(subunit va
13、ccine)制备不含有病毒核酸、仅含有能诱发中和抗体的病毒衣壳蛋白或包膜表面抗原，是最理想的疫苗。 3.合成肽病毒疫苗(synthesized peptide viral vaccine)人工合成与病毒保护性抗原决定簇的氨基酸序列相同的肽段，制备成免疫原后免疫动物或人体，使机体产生保护性抗体,4.基因工程疫苗(geneenginering vaccine)利用基因工程技术，分离、重组、转化和表达基因，制备出的能引起人体保护性免疫应答疫苗。 5. DNA疫苗 又称基因疫苗或核酸疫苗，这种核酸分子是一种细菌的质粒，在克隆了特异性的基因以后，能在真核细胞中表达蛋白质抗原，刺激机体产生特异性体液和细胞
14、免疫 。6.新型多价联合疫苗、口服疫苗的研究,减毒活疫苗与死疫苗优缺点比较,二、人工被动免疫,人工被动免疫的制剂有免疫血清和丙种球蛋白，或与细胞免疫有关的因子等。大多数人均受过不同种类的病毒感染，从正常血清中提取免疫球蛋白可用于紧急预防。常注射人免疫球蛋白预防甲型肝炎、麻疹、脊髓灰质炎等。可使接触病原者不出现症状或仅出现轻微症状。近年来有人应用含有高滴度抗HBs的乙肝免疫球蛋白Ig) 预防乙型肝炎有一定效果。在使用免疫球蛋白时因其半衰期短，故应注意有效期。,第三节 病毒感染的治疗,一、抗病化学制剂（一）核苷类药物 核苷类药物的作用机制有主要是抑制病毒基因复制模拟核苷成分掺入病毒基因组：合成的异
15、常嘧啶取代病毒DNA前体的胸腺嘧啶，病毒在复制过程中，这种异常的嘧啶分子掺入子代DNA中使子代病毒结构基因的合成和表达无法进行，从而抑制病毒的复制，或复制出的病毒为缺陷病毒。 竞争病毒复制酶,1.无环鸟苷 (acyclovir,ACV，阿昔洛韦)和丙氧鸟苷（ganciclovir GCV，庚昔洛韦）为鸟嘌呤或脱氧鸟嘌呤核苷类似物。 该药细胞毒性很小，是目前最有效的抗疱疹病毒药物之一。广泛用于疱疹病毒感染引起的单纯疱疹、生殖器疱疹及带状疱疹。,2.叠氮胸苷 (azidothymidine,AZT) 胸腺嘧啶核苷类似物，通过阻断前病毒DNA的合成而抑制HIV的复制，AZT对病毒逆转录酶的抑制比对细
16、胞DNA多聚酶敏感100倍以上。可以有效地降低AIDS的发病率与病死率。耐药株的出现系由基因突变导致逆转录酶具有耐药性。因有抑制骨髓作用和形成病毒的耐药而面临被淘汰。,3.病毒唑 对多种RNA和DNA病毒的复制都有抑制作用，但主要用于RNA病毒感染的治疗，对细胞的核酸也有抑制作用。目前临床主要用于流感病毒和呼吸道合胞病毒的治疗。,（二）病毒基因转录抑制剂,这类核苷衍生物模拟天然二脱氧核苷底物，经一系列磷酸化成为5-三磷酸后，作为相似的底物竞争性抑制病毒逆转录酶活性。被磷酸化的药物分子与核苷酸分子相似，在RNA模板合成DNA过程中被嵌入DNA中。此DNA再转录时，由于其中的药物分子不是正常的核苷
17、酸，因而转录酶不能识别，从而使转录受阻。,（三） 非核苷类逆转录酶抑制剂,nevirapine 第1个新合成的非核苷类逆转录酶抑制剂。1996年获准用于治疗HIV，耐药株已出现，故建议与其它药联合使用；pyridone 作用类似nevirapine.,（四）蛋白酶抑制剂,1赛科纳瓦(saquinavir) 1995年批准的第1个蛋白酶抑制剂。 2英迪纳瓦（indinavir）、瑞托纳瓦（ritonavir）是1996年批准的新一代蛋白酶抑制剂，用于HIV。,（五）其他抗病毒药物,1.金刚烷胺和甲基金刚烷胺 金刚烷胺为合成胺类，甲基金刚烷胺是其衍生物，两者有相同的抗病毒谱和副作用，能阻止脱壳，主
18、要用于治疗甲型流感。2.甲酸磷霉素 无机焦磷酸盐的有机类似物，抑制多种疱疹病毒，包括CMV、HSV、VZV、EBV、HHV6，可能还对HBV和逆转录病毒有作用。选择性抑制病毒DNA多聚酶和逆转录酶，而对宿主细胞无影响。,二、干扰素和干扰素诱生剂的应用,1. 干扰素(IFN) 具有广谱抗病毒作用，毒性小，使用同种IFN无抗原性，主要用于甲、乙、丙型肝炎，HSV，乳头瘤病毒和鼻病毒等感染的治疗。反复应用也会引起耐药性。2. IFN诱生剂 如： poly IC、甘草甜素、芸芝多糖 。,三、中草药防治病毒感染,中草药如黄芪、板蓝根、大青叶、贯众、螃蜞菊以及甘草和大蒜提取物等均有抑制病毒的作用，对肠道病毒、呼吸道病毒、虫媒病毒、肝炎病毒感染有一定防治作用，其作用机理尚在研究中。,五、免疫治疗,免疫治疗病毒感染可应用特异性抗体、非特异性免疫调节剂和治疗性疫苗等。根据不同的病程，早期应用中和抗体，可阻断病毒在体内血液中的扩散，控制病情的发展。我国已用针对乙脑病毒包膜抗原的单克隆抗体，治疗乙脑患者有效。鼠源性单克隆抗体在体内存留的时间不长，并可引起超敏反应，现国外均致力于研制人源单克隆抗体，或研制重组表达人源抗病毒单克隆抗体。,THE END,
