1、中南民族大学 药学院化学生物学教研室,尼龙固定化木瓜蛋白酶,化学生物学实验,1.实验目的,化学生物学实验,6学时,1,2,学习尼龙固定化木瓜蛋白酶的原理和方法。,掌握共价结合法固定化酶的原理和方法。,中南民族大学 药学院化学生物学教研室,2.实验原理,化学生物学实验,6学时,1,2,3,4,酶不与产品混合，制品易于纯化。,在大多数情况下，可提高酶的稳定性。,提高酶的使用效率，降低生产成本。,利用固定化酶，工业上可以大批量、连续化生产,定义：通过物理或化学的方法，将水溶性的酶与水不溶性载 体结合，使酶固定在载体上，并在一定的空间范围内 进行催化反应的酶称为固定化酶。,固定化酶的优越性主要表现在：
2、,2.实验原理,化学生物学实验,6学时,包埋法,共价键结合法,交联法,酶的固定化方法有：,吸附法(物理吸附、离子吸附),1,2,3,4,2.实验原理,化学生物学实验,6学时,本实验尼龙固定化木瓜蛋白酶属共价键结合法。尼龙长链中的酰胺键经HCl水解后，产生游离的-NH2基，在一定条件下与双功能试剂戊二醛中的一个-CHO基缩合，戊二醛中的另一个-CHO基则与酶中的游离氨基缩合，形成尼龙(载体)-戊二醛(交联剂)-酶，即尼龙固定化酶。,NH(CH2)6NHCO(CH2)4COn,HCl,R-CH2-NH2,OHC-CH2-CH2-CH2-CHO,R-CH2-N=CH-CH2-CH2-CH2-CHO,
3、目标产物,3.实验材料、试剂及仪器,化学生物学实验,6学时,材料,(1)尼龙布(86或66)，140目，剪成3 cm3 cm大小的方块(2)吸水纸,仪器,(1)恒温水浴锅 (2)紫外分光光度计 (3)冰箱及玻璃器皿,中南民族大学 药学院化学生物学教研室,3.实验材料、试剂及仪器,化学生物学实验,6学时,(1)18.6% CaCl2溶液 (2)甲醇溶液 (3)3.65 mol/LHCl溶液 (4)0.2 mol/L硼酸缓冲液(pH值8.5) (5)5%戊二醛溶:用0.2 mol/L,pH值8.5的硼酸缓冲液配制 (6)0.1 mol/L硼酸缓冲液(pH值7.8) (7)1 mg/mL木瓜蛋白酶溶
4、液 (8)0.1 mol/L磷酸缓冲液(含3% NaCl) (pH值7.2) (9)0.1 mol/L磷酸缓冲液(pH值7.2) (10)激活剂：用0.1 mol/L磷酸缓冲液(pH值7.2)配制，内含 20 mmol/L半胱氨酸、1 mmol/LEDTA的混合液。 (11)1%酪蛋白溶液：用0.1 mol/L磷酸缓冲液(pH值7.2)配制。 (12)10%三氯乙酸(TCA)溶液。,主要试剂,4.实验步骤,1、固定化酶的制备 (1)每组取5块尼龙布洗净、晾干，浸入10 mL混合液（取1.86 mL 18.6%CaCl2溶液加入8.14 mL甲醇溶液中，注意要现配现用） 中10s左右，取出后用水
5、冲洗 、干净，用吸水纸吸干。 (2)尼龙布用3.65 mol/L HCl溶液在室温下水解45min，用蒸馏水 冲洗三次至pH中性。 (3)将尼龙布用5%戊二醛溶液在室温下浸泡偶联20 min。 (4)取出尼龙布，用0.1 mol/L 磷酸缓冲液(pH值7.2)反复洗涤， 洗去多余的戊二醛，吸干之后，立即用酶液(0.51 mg/mL)在 4下固定3.5 h(酶液用量每块尼龙布不宜超过0.8 mL)。 (5)从酶液中取出尼龙布(保留残余酶液作测定用)，用 0.5mol/LNaCl溶液(用0.1 mol/L，pH值7.2的磷酸缓冲液配制)洗去多余的酶蛋白，即为尼龙固定化酶。,化学生物学实验,6学时,
6、4.实验步骤,化学生物学实验,6学时,2、酶活力测定(1)溶液酶活力测定：取0.2 mL酶液，加入2.3 mL激活剂，于 37 下预热10min，加入37预热的1%酪蛋白溶液mL， 准确反应10 min，然后加入10%三氯乙酸溶液1.5 mL终止 酶反应。对照管先加入10%三氯乙酸溶液，后加酪蛋白溶 液，其他与测定管相同，以8000 r/min的转速离心10 min或 过滤，取其上清液于波长280 nm处测定吸光度。在上述条 件下，每10 min增加0.001个吸光度为1个酶单位(U)。(2)残留酶活力测定：方法同溶液酶活力测定。(3)固定化酶活力测定：取一块尼龙布固定化酶，加入2.5mL激 活剂，其余步骤与溶液酶测定相同。,5.实验数据处理及计算,化学生物学实验,6学时,活力回收=,固定化酶总活力数,溶液酶总活力数,100%,相对活力=,固定化酶总活力数,(溶液酶总活力数-残留酶活力数),100%,6.注意事项,尼龙布的处理是本实验成败的关键，既要让其充分地活化，又不能使其破碎。,固定化酶溶液浓度最好为0.51 mg/mL，对每块尼龙布用量不宜超过0.8 mL。,酶活性测定的反应时间一定要准确。,过滤操作要规范。,化学生物学实验,6学时,中南民族大学 药学院化学生物学教研室,
