1、AML中的微小残留白血病,Steven M. Kornblau, M.D.Department of LeukemiaDepartment of Stem Cell Transplantation and Cellular Therapy,现状,多数患者获得缓解80% 60 岁或有既往血液病多数复发治愈率 20-25% ， 2/3rd 复发我们能早期检测残留疾病吗?如是, 这些信息有助于我们处理患者吗?,微小残留白血病,诊断时,LeukemiaChemoResistant?,Normal,LeukemiaChemo Sensitive,诱导后 14 天,Primary Refractory,C
2、R,后期某个时间,Is MRD present?Can we Detect it?Can we use this information,MRD 目标,某个时间点残留疾病的测定何时?哪种标志?MRD 检测提供的特征可以增加预后信息诊断时不能忽视预测复发vs. CCR 的阈值可被定义什么水平是可以被警告的?治疗反应的依据检测到 MRD 更多或不同的治疗检测不到 需要较少的治疗, 较少的毒性.作为一种有效性的替代指标?,AML 中MRD 的障碍,定义追踪的标志不总是存在细胞遗传学突变流式没有标准化的方法标准化的阈值没有界定测量到的连续变量, 对分的期待终点.一种可以改善结果的治疗尚不存在.,Co-
3、occurrence is frequent creates added complexity When multiple events are present which do you follow?Are effects: Additive, cancel each other out, synergistic?,何时监测 MRD?,一个时间何时? 诱导后立即 CR1时, 3 个月时? .连续地何时开始? 频率?约 2 周重复相同或升高 认为分子学复发 处理?下降或持平, 2 周后重复,针对 MRD如何反应(变换)?,Hokland Blood 2011; 117:2577-84,MRD
4、检测的方法,多参数流式 检测限度 1:10-4更快RT-PCR分析的局限性, 靶基因等. 细胞系的实验 “spiked” 1:10-3 to 10-7 操作患者标本 1:10-4 to 10-5耗时好标致 PML-RAR, NPM1, MLL, CEPBA, WT1 EVI1(Mecom) PRAME正常骨髓所有的突变在某些水平可提供阳性信号再生骨髓与 “正常l” 骨髓不同 文献常错误地将 “检测的限度” 或 “最低可能阈值”冠以 “敏感性”,Hokland Blood 2011; 117:2577-84,多少次是检测的时间? 有关系吗?,AML N=79, 中位年龄 42.5 (20-67)
5、 RQ-PCR 的频率中位n 74 每例患者标本,范围 10-237 但未设立计划 6-60 个月.标准方案治疗, 如果 MRD+ 可做 SCTCR: 23 / 24, 分子学 CR (PCR-) ：11/2417例33 次复发 PB 和 BM- 强相关性 (R= 0.8)全BM 合 CD34+ 和 CD34- 强相关性 (R=.9)中位时间为 25.5 天, 范围 8 to 79 天中位 MRD+ PFS 治疗是 119天抢先治疗延迟但没能防止复发.,Doubek (ExpHem2009;37:659-672),CR1 早期干预有益吗 ?,化疗. 延迟但不能防止复发 Platzbecker
6、Leukemia 2012;26:381-89很多试验在进行中Pedi- Clofarabine + ara-C for MRD 0.1%Adults Ceplene + low dose IL2Anti CD33-gemtuzumabDendritic cell vaccinationAzacitidine or DecitabineAllo SCT- 有争议的好处成人Walter JCO 2011; 29:1190-97 儿童Rubnitz. Lancet Oncology 2010;11:534-552WT1 Jacobson Br J Haem 2009:146:2709-16Leun
7、g Blood 2012; 120:468-72,PCR,采用突变的问题,突变部位变化, 插入部位, 长度诊断或复发时是多克隆小克隆扩增诊断和复发时突变状态可改变突变飘移 如. FLT3-ITD丢失或获得突变不稳定性影响了这些标志作为监测 MRD的应用应用 下一代测序追踪随着时间延长发生的克隆演变可能有用但昂贵.,复发的动力学影响监测的频率和标本来源,较慢的,较快的,NPM1-mut & FLT3-ITD,NPM1-WT & FLT3-ITD,PML-RAR,RUNX1,CBFB-MYH11,NPM1,WT1,外周血,骨髓,监测标本:,PML/RAR 以定量 RT-PCR 是标准方法所有还是高
8、危患者?诱导后ATRA 35:3-7如果MRD阳性时不做移植将影响自体移植质量 (GIMEMA)持续阳性可用异体移植挽救.连续监测. 跟随欧洲癌症项目 (Leukemia 2003, 14:2318-57)骨髓较外周血更敏感. 1.5 Log.巩固后，Q 3 个月共 36 个月经济益处 $4-11K/QALY,APL的MRD,APL 单用 ATO 治疗,Chendamarai Blood v119:3143 2012,151 例单用砷剂治疗.2 步巢式 Q-PCR, 以BIOMED-1 方法, 定性研究欧洲癌症项目Sensitivity 10-3 after 1st round, 10-4 a
9、fter 2nd round Ct = PML-RAR/ABL * 100 Negative if beyond 4020.5% relapsed, median 15 mo,%+ 100 63% 18% 0%RR 4.8 NSSensitivity 86.7%Specificity 42.3%,Lead time provided by detection of conversion31 relapses15 4 months10 never pos6 not doneFalse Positive conversion4.6% (8/151),CBF AML,inversion 16 假阳性
10、很少见qRT-PCR 标准化的欧洲癌症项目比值 w.r.t. 2M 53例 伴 inversion 16, 年龄 16-6013 个标本/患者, blood vs. BM, Diagnosis, Induction cycle #1 and #2, Consolidation #1,2,3,Follow up 3 6 9 12 15 18 24 36 72 mo 骨髓更敏感治疗前与骨髓原始细胞%相关, 与其他临床特征无关巩固后下降的动力学与结果无关 巩固后 59% 阴性, 2年 RFS 阴性者 70% vs. 阳性者54%14 例阳性, 10 r复发- 从未获得阴性 (Median 1190)
11、 35 例阴性, 3复发, 2 转为 10 copies追踪- 29 阴性在某些治疗点, 10 转化, 6 例复发. 3例时间点为 3, 5 , 6个月, 但3例在复发时.,Corbaciaglu JCO 28:3724-3729 2010,Wilms Tumor 1,90% AML过表达, 突变 10%Phase I- tested 9 RQ-PCR protocols in 11 labs, cut 3Phase II tested 6 in 11 labs, selected best 3Phase III tested 3 protocols on several standards,
12、 picked the best正常人作为参比-常用表达118 PB, 61 BM , 25 G-CSF stim PB检测 Diagnosis 238 PB, 382 BM, 15 with WT1 mutationAfter Anthra+ ara-C therapy N=129, 16 repetitively结果Blood = BM at Dx and MRDMutant = wild typeHigh levels in Inv16, FLT3itd, NPM1,Cilloni JCO 2009;27:5195-5201,诱导后下降有意义, 2 log巩固后水平也有意义,NPM1,潜
13、在的巨大靶点，约 30%有突变以 PCR 检测，有17 种不同的突变. Type A= 80%, B ,D = 6% eachLimit of detection 1:10,000 to 1:100,000追踪252 NPM1 突变的 AML，84 例复发47 MRD+ 15-221 days (median 62) before relapse15 never MRD- Failure to get 3 log reduction = relapse31 MRD not + before relapseAll relapses had the same NPM1 mutationSensit
14、ivity = 62/93 =66%,Specificity? Not stated.许多时间点有意义Allo SCT 后有预示意义,Schnittger Blood 2009;114:2220-31,ALLO SCT 后的MRD,MRD 升高预示复发如果存在可以分子学标志嵌合体: 受-供者比例, 特别是在 CD34+细胞 Verneris Curr Het Malig Rep 2010;5:157-162快速的复发动力学导致 MRD 应用困难根据的MRD反应干预显示延迟但不能阻止复发Azacitadine. Platzbecker Leukemia 2012;26:381-89,MPFC,多
15、参数流式细胞仪,仅 50% 的患者有 PCR 适合的标志予以追踪80-94% 有流式组合Leukemia Associated ImmunoPhenotype, 诊断时定义诊断时定义“与正常不同”给予定量结果何时评估?应用何种阈值?范围 0.035 to 1% 常用 0.1%. 应用 0.01% 无预测价值 (Leung Blood 2012;120:468-472)分析多少细胞?如 20 个细胞为一簇可定义为 MRD200,000 events 1:10:000 = 20 cells 推荐 1 million因非所有的原始细胞都表达这个组合. 几乎所有的研究应用的水平源于回顾性的并缺乏 确认
16、的群体.See Ossenkoppele Br J Haem 2011;153:421-436 for review of literature,必须在诊断时检测 LAIP 并追踪可以多于一种 LAIPMust follow all of them to pick out minor clones that expand.与正常不同 应用一个组合并寻找特征性组合.不同步表达非常有用.如CD34+ 和 CD123+系列不忠有用. 如. CD7 (淋系) 在 AML 原始细胞的表达异常表达相关伴有细胞遗传学异常 AML1-ETO : CD19+, CD11a- CD56+/- cCD79a = p
17、oor prognosisCBF MYH11: CD2+T(15:17) : CD56 in 20%= badNPM1: CD13, CD117 CD110 CD123CEBPA: 7+ S&S 最好用 6种以上颜色流式, LSC 抗体 & 多重髓系抗原 白血病干细胞频率CD34+ CD38- CD123 CLL-1 CD44 CD47 CD96 & 相同的异常标志.低频不利,白血病相关没有表型 Vs. “与正常不同” 方法,背景 = 正常细胞表达的限制了敏感性和特异性, 可提高检测的限度 0.1% to 1%背景在 PB比. BM 低非所有细胞表达异常标志降低敏感性免疫表型漂移可高达 91%
18、多数病例有多种 LAIPs 降低了假阴性率.但寻找诊断时的组合将丢失新出现的组合流式需要专业人员操作标准化的流程和自动分析将有助Schuurheis Expert Rev Hem 2010;3:1-5),多参数流式细胞仪潜在的问题,MPFC 在 AML的预后价值研究汇总,Ossenkoppele Gr J Haem 2011:153;421-436,作为MRD 通过流式监测 LSC,CD34+CD38- & Positive for CD123 CD117 CD25 Negative for HLA-DR诊断时的频率预测复发治疗后持续阳性预示复发BM 优于 blood罕见降低敏感性罕见标志变化
19、存在 C-type lectin like (CLL-1), 不见于正常,MRD 在 儿童AML- AML02 研究,Induction 1 with high vs. low dose ara-C + Dauno and etoposideMRD#1 on day 22, if 1% positive then immediately to induction 2, otherwise wait for recovery of counts then to induction 2 Induction 2 ADE +/- Gemtuzumab-ozogamicinMRD#2 by Flow m
20、easurement after 2nd indutionLow HDAC x 3. Good cyto more often negativeHigh Allo (n =59). Bad cyto more often positive 216 AML enrolled 202 evaluable for MRD #1, 193 for MRD#2Use of high dose ara-C no effect. Use of GO increased conversion to MRD-,MRD most powerful in multivariateCBF, 11q23 and FLT
21、3 stay in the modelTriage to ALLO didnt seem to help the high risk group,通过流式加细胞遗传学监测MRD,Favorable & Intermediate cytogeneticsBut not to unfavorable or FLT3-ITDFLT3 WTMRD+ addsFLT3-ITDDoesnt add,Buccisano Blood 2012;119(2);332-341,MRD -,MRD +,MRD -,MRD +,Survival% in Remission,在成人AML 以流式监测MRD,233 co
22、nsecutive Adults Median age 42+ 18CytogeneticsFav n=49 (Includes 43 APL) Int = 35 Unfav =10 Unk=323 color + FSC, SSC at diagnosis and remission. 15K event followed by live gate on larger # of cells Looked for SAME phenotype as at diagnosis 175 aberrant IP 126 CR with 3+7 x 2 + HDAC+ anthra x 216 to Auto SCT 12 to Allo,1%,0.1%,0.01%,1%,0.1%,0.01%,San Miguel Blood 2001;98;1746-51,MRD- 需要什么,标准化分析和界值前瞻性研究以评估多中心多中心实验室临床研究证实MRD指导下的治疗改善结果预后良好组结果好 , PML-RAR, CBFB-MYH11, NPM1 预后不良 AML需要标志有效的新治疗,
