1、第七章 受体的放射分析,1. 概 论,受体:细胞表面或亚细胞组分中的一种分子，可以识别并特异地与有生物活性的化学信号物质（配基）结合，从而激活或启动一系列生化反应，最后导致该信号物质特定的生物效应。迄今为止，所有已发现的受体都是具有特定氨基酸序列和特定构型的蛋白质。每一种受体在细胞上都有特定的宏观分布和微观分布。,一、受体功能,（1）识别特异的信号物质-配基，识别的表现在于两者的特异结合。（2）把识别和接受的信号准确无误的放大并传递到细胞内部，同时启动一系列胞内生化反应，最后导致特定的细胞反应， 使得胞间信号转换为胞内信号。,二、受体的分类:1、膜受体 跨膜 2、核受体 细胞内,受体的亚型：指
2、受体分子结构上既有部分相同之处，也存在部分差别，它们对一定的配基有不同的亲和力，在生物学上具有各自不同的效应。受体亚型的区分是生物进化的结果，有利于机体处理信息的能力及适应性更强。受体数量：占细胞蛋白总量十万之一到百万分之一（一个细胞上仅有数千个受体分子），一般方法难以分离和测定受体分子。,配体：是指能和受体结合并引起相关效应的化合物。除了与受体结合外本身并无其他功能，它不能参加代谢产生有用产物，也不直接诱导任何细胞活性，更无酶的特点，它唯一的功能就是通知细胞在环境中存在一种特殊信号或刺激因素。,配体与受体的结合是一种分子识别过程，它靠氢键、离子键与范德华力的作用，随着两种分子空间结构互补程度
3、增加，相互作用基团之间距离就会缩短，作用力就会大大增加，因此分子空间结构的互补性是特异结合的主要因素。 同一配体可能有两种或两种以上的不同受体，例如乙酰胆碱有烟碱型和毒蕈型两种受体，同一配体与不同类型受体结合会产生不同的细胞反应。如 Ach可以使骨骼肌兴奋，但对心肌则是抑制的。配基可以是神经递质、激素、某些药物等。,三、跨膜受体的信号传递通路 跨膜受体是含糖或不含糖的蛋白质分子，它的主要作用是将细胞外的信号传导到细胞内，信号再从细胞浆传递到效应器，最后是一个特定的生物学效应。信号的这种传导过程称为信号传导通路（signal transudation pathway），它是当今生物学领域中一个重
4、大的研究课题。,四、受体与配基结合的特性,1、可饱和性（satiability）：受体结合反应呈高亲和性和低容量，而非特异结合则呈低亲和性和高容量，后者的剂量反应曲线不呈可饱和性。2、可逆性（reversibility）：激素、递质和药物与特异性受体结合反应是可逆的，当受体周围的配基浓度降低，结合反应就逆向进行，即配基受体复合物很快解离，解离后的配基是原形，不起代谢变化，这跟酶与底物作用结果不同，底物经酶作用后变成代谢产物。,3、特异性和亲和性 受体具有特异识别配基的性能，因此只有严格构型和构象的配基分子才能选择性地与受体结合。受体的特异性还表现在器官或组织（靶器官）的专一性上，如雌激素对子宫
5、、阴道、乳腺等器官有兴奋作用，这是因为这些器官上雌激素受体的数量明显高于非靶器官。受体的亲和性是指受体和配基的结合能力，受体亲和性高就说明受体和配基结合的牢固，不容易解离。,4、与效应的一致性 受体的主要功能是介导配基的生物效应，如果一种蛋白能与某种物质结合而不介导特定的生物效应，那么这种蛋白不能称之为受体。所以用生物效应作为观察受体和配基性质的标准是十分必要的。从配基的角度分析，有的是阳性效应，有的是阴性效应。阳性效应就是配基与受体结合后引起阳性生理效应，称为激动剂。阴性效应就是配基与受体结合后不但不引起阳性生理效应，而且阻断内源性配基的阳性生理作用，称为拮抗剂或阻断剂。,五、受体的生理调节
6、,正常生理状态下的受体处在一个不断合成与降解的动态平衡中，但其数量和亲和性也会因疾病、药物作用而发生变化。1、向下调节（down-regulation） 细胞所处环境中某种激动剂的浓度增高或长期作用，其结果使相应受体的数量减少，并出现受体对此物质的敏感性下降，或耐受性增高等现象，如哮喘病人长期服用-激动剂产生的耐受性增高，即药效减弱。,2、向上调节（up-regulation） 细胞所处环境中某种拮抗剂的浓度过高或长期作用，结果会使受体数量增高，出现受体敏感性增高，表现为增敏，或撤药后反跳现象。如高血压病人长期服用心得安时对儿茶酚胺增敏，若突然停药，可出现血压升高的反跳现象。由于受体在整体条件
7、下，随机体状态变化，会出现生理调节，因此对受体数量和亲和性测定就成为研究病理变化和评价药效的重要内容。,六、受体与疾病,遗传缺陷与免疫异常为受体性疾病的常见原因 1、基因突变致使受体异常，引发功能障碍，绝大多数是功能降低或完全丧失，有家族史，病情严重。如睾酮受体基因突变致该受体缺陷引起睾丸完全雌性化病。2、机体对受体产生自身抗体，激动（如Graves综合症患者产生TSH受体抗体，直接持续激动甲状腺TSH受体）或阻断（如重症肌无力患者产生N-Ach受体抗体，占领但不记得受体）受体。3、某些病有受体异常，非原始发病环节，为发病重要环节，采取针对措施可控制病情。甲亢用肾上腺素阻断剂，哮喘用肾上腺素激
8、动剂。4、受体与肿瘤：激素受体在肿瘤中存在与否决定治疗方案（乳腺癌 白血病）；某些受体基因可突变成为癌基因，引发肿瘤。,2.受体配基结合反应的基本原理,RBA的基本原理与IRMA基本相同，应用放射性标记配体，在一定条件下与受体（R）结合成配体与受体复合物（R*L），分离并测定R*L的放射性，然后经数据处理，可测得受体的亲和力和受体的数量。,一、受体与配基相互结合的基本规律（一）质量作用定律（mass action law） 简单单位点系统：指对某种受体而言，它的全部受体都以相同的亲和性以单分子与特定的配基相结合，而且不表现明显的正负协同作用，理论上讲结合后产生的生物效应也应完全相同。这种系统称
9、之为。 有时，一个受体系统中存在两（多）种亚型，但所用配基无选择性，尽管亚型的生物效应可能不全相同，结合反应却表现出完全相同的特征，这时，也可作为单位点系统来看待。,（二）复合物的浓度和配基浓度的关系：,可以看出，RL和LT 并非线性关系，而是曲线关系，对一定数量（RT固定）和一定亲和力（KD固定）的受体来说，配基浓度从零开始上升时，复合物浓度先是上升很快，以后逐渐变慢，最后绝大多数受体都变为复合物，也就是受体被饱和了。这就是饱和曲线 （saturation curve)（图91）。,曲线的高度主要反映受体的数量多少，曲线上升的快慢则主要反映受体和配基的亲和力。,（三）非特异结合（non-sp
10、ecific binding，NSB） 上述饱和曲线是受体与配基的特异结合形成的。这种结合的特点是低容量和高亲和力，所以容易饱和。但是，任何受体标本除特异结合外，还会有一部分非特异结合，当分离特异结合的复合物测量放射性时，这部分非特异结合的放射性混在一起，测到的是总放射性（total binding，TB），必需先减去非特异结合（NSB），才能得到特异结合（specific binding，SB）的放射性。,NSB主要来自杂蛋白，反应器壁，分离材料的吸附，它的特点是，容量很大，而亲和力低，因此在一般情况下不被饱和，也就是随着配基浓度的升高，它不呈饱和曲线，而是一条上升的直线（图9l）。另外，如
11、果系统中存在大量同种受体的非标记配基，则放射性的SB被非标记配基取代，而NSB由于容量很大，空余的位点很多，放射性不被取代。所以要从TB中减去NSB，最基本的办法是做一系列平行管，所有的条件都与 TB管相同，只是多加 1001000倍量的非标记配基，将SB完全取代掉，这时的放射性结合即为NSB。由于NSB和放射配基呈直线关系，多点饱和法的实验中往往只需做34点，再用直线回归法求出其余各点的放射性。,（四）正负协同作用,当一部分受体与配基结合后使相邻的受体的亲和力发生改变，倘若亲和力逐步下降，称之为负协同作用如曲线（2） ，亲和力逐步增大，称之为正协同作用如曲线（3）。,（五）受体与配基反应的动
12、力学（kinetics）,受体与配基的结合反应一般都较快（多数在数十秒至数十分钟）达到平衡。当周围的游离配基急剧下降，或非标记配基浓度急剧升高时，放射性复合物的解离也很快，这种快速结合和快速解离对保证受体的迅速反应有很重要的意义。,（六）竞争性取代反应 在一个受体和放射配基的反应系统中加入另一个化合物，它若能和受体的结合位点结合，则会与放射配基竞争与受体结合，最终将表现为放射配基与受体形成复合物的能力降低，但受体数量不变,所以叫竞争性取代反应。此时，非标记的起竞争作用的配基称为竞争剂,它们和受体结合后不改变受体分子的结构。,表示竞争剂抑制作用强弱的指标有二个：IC50值和KI。IC50值是指抑
13、制50受体与放射配基结合所需竞争剂的浓度，IC50值大，表明竞争剂抑制作用小。KI则是指竞争剂的平衡解离常数，KI越小，表明竞争剂抑制作用越大。,二、双（多）位点系统 一种配基可以和两种以上的受体亚型结合，每种亚型都有相应的KD值（自学）。,3. 受体放射分析的基本方法,离体RBA基本方法的流程为：,一、放射性配基的要求 制备优良的放射性配基是受体结合试验的首要条件。对任何一种受体系统，通常都有好几种标记配基可供选择。选择应从两方面考虑：配基的特性；实验目的。 （一）对放射性配基的基本要求1、高比活度：组织细胞内的受体浓度一般都很低，约104-105个/细胞，或0.01-3.0 pmol/mg
14、蛋白的水平，低比活度的配基难于达到分析灵敏度的要求。,一般要求配基比活度至少在3.71011Bq（10Ci）mmol以上。另外，配基比活度高，加入反应管的放射性配基量才有可能减少，从而有利于用小量标本得到可靠的数据，并有利降低非特异性结合率。,2、高亲和力:亲和力高，可以减少标记配基用量，从而既可降低非特异性结合，又可使放射性配基与受体的结合物解离变慢，便于进行结合和游离配基的分离。不仅方便操作，而且获得的数据准确。,3、特异性强:即该配基与所研究受体有选择性结合，理想的是该配基只与一种受体或受体亚型结合。但没有一种配基是完全选择性的，所以要结合实验研究的目的，选择对某一受体或其中某一亚型亲和
15、力高的放射性配基。4、高的稳定性及放化纯度:包括标记的稳定性、贮藏时的稳定性以及温育分析时之稳定性,同时具有95%以上的放化纯度。 总的来说,配基的选择要根据实验目来定。,目前，用作受体放射分析的放射性配基多用3H、125I标记。 3H标记配基与原型配基为同型式，生物学活性好，多数情况下比活度也能达到要求，且半衰期长，使用方便，主要缺点是需用液闪测量，操作较麻烦，一般实验室不能进行标记。多肽及蛋白质配基多用125I标记，其优点是可以达到较高的比活度。只要很好掌握标记条件，仍能保持较好的生物活性。另外，碘标记法快速、方便、经济，一般实验室可进行。,（二）放射性配基的质量鉴定 1、放射化学纯度:
16、除新鲜产品外,存放一定时间后的标记配基均应重测其放化纯度，以保证分析的准确性。一般要求放化纯度应在95以上。 2、结合活性鉴定 3、比活度：受体结合分析的结果计算离不开准确的比活度数据。,二、受体标本的制备 在受体结合实验的研究中，所用的受体材料可以是组织切片，也可以是完整的单层培养细胞或游离活细胞，粗制的或纯化的细胞膜受体，可溶性的受体蛋白等。,（一）组织切片 冷冻组织切片常用明胶粘贴于玻片上，在温育缓冲液中与标记配基进行反应。反应后用缓冲液洗几次即可，切片厚度一般为5-50m。用组织切片的目的更多是研究受体的分布（用放射自显影法或免疫组化）。,（二）游离的完整细胞悬液 完整的活细胞可以是血
17、细胞，培养的单层细胞，肿瘤的腹水型细胞以及经处理的原代细胞等，使用完整细胞的优点：1、受体处于原有的正常环境中。膜未受扰乱，膜内pH、离子梯度也保存着。受体与其相连的效应系统（如G蛋白）也保存完好。2、在受体功能反应完全的情况下研究受体，可以同时观察配基与受体结合的情况和细胞的生物效应。所得的结果更能反映受体的生理特点。3、能直接给出平均每一个细胞的受体数。,但完整细胞的受体分析较难控制分析条件。操作过程可能导致细胞表面生理活性的改变，因此结果有时不够稳定。另外，若细胞上某种受体的含量低，作分析时需加入大量细胞才能获得足够的放射性计数，给实际工作带来一定困难。完整细胞来源分三种：从组织分离出游
18、离细胞；血细胞；培养细胞。一般都需采用台盼蓝等检查细胞活性。,（三）膜制剂（membranous preparation） 绝大多数受体结合分析使用膜制剂。使用膜制剂可以减少非特异性结合率。而且，在膜制备过程中，通过洗膜的方法，可以将内源性配基洗去，并除去部分蛋白溶解酶。膜制剂通常也保存有受体-效应器结合系统。但受体功能的其他方面则失去了。另外，膜内离子浓度梯度、受体与细胞结构关系也失去了。但是，受体结合需要的是膜双层脂质结构本身，而不是细胞内其他组份。所以膜碎片内仍保留受体的药理学特性。,细胞膜和细胞浆受体的制备一般都利用蔗糖密度（0.250.3molL）梯度离心法分离不同的亚细胞组分。其优
19、点是除去大部分杂蛋白，以减小非特异结合。为保证所制得的膜受体保持良好的结合活性，需注意：全部过程在0-4下进行操作。制备缓冲液的蔗糖密度，离子强度，pH值及其它物质（如 EDTA，Mg2）应严格控制。组织匀浆条件应保持一致。离心的时间、速度、温度应保持恒定。为防止膜受体蛋白被蛋白酶水解常加蛋白酶抑制剂。,细胞组份的分离一般采用差速离心法。通过适当控制离心力及离心时间可使某些颗粒组份沉淀，而另一些保留在上清液中。细胞组份的一般分离流程如下：,三、结合反应的类型 （一）标记配基饱和法1、单点饱和法：定量受体制剂加大量的标记配基使受体得以饱和结合。根据受体-配基复合物的放射性计算受体结合容量（或结合
20、位点数）。这种方法操作简便、标本用量少。但只凭单点实验数据计算受体结合容量，比多点法的结果略低，不能给出KD，误差也相对大些。,2、多点饱和法：一定量的受体制剂，逐步增加标记配基的量（一般7-8个实验点），使受体的结合趋于饱和。用曲线拟合法或直线拟合法计算受体结合容量和亲和力（RT、KD），结果可靠性高。但受体标本、标记配基用量大，工作量大。,（二）非标记配基饱和法 一定量的受体制剂和标记配基，逐渐增加非标记配基（一般78个实验点），使受体饱和结合，曲线拟合法或直线拟合法计算受体结合容量和亲和力。这种方法克服了多点饱和法标记配基用量大的缺点，但由于非标记配基的用量逐渐加大，放射性逐步减少，必需
21、标记配基比活度较高才能得到满意结果。,四、分析条件的选择 （一）标记配基浓度 （二）受体浓度 （三）温育温度与时间 （四）缓冲液,五、结合与游离配基的分离 受体-配基结合分析主要是测定反应平衡时结合配基的量，求解受体的密度与平衡解离常数。反应一般在达到平衡后先经分离，再测结合部分的放射性。理论上，一经分离，反应的平衡就会被破坏，所以选择适当的分离方法和环境，使受体-配基复合物在分离过程中的解离减少到最低限度。低温是降低解离的最有效手段，分离快慢也是重要因素。 常用的分离方法有离心法、滤膜法、吸附法、透析法、电泳法等。若复合物解离快，则只能选择快速的分离方法。同时一定要在分离时间，分离温度等方面
22、保持各样品管之间的一致性，以减少误差。,4.受体放射分析的数据处理及应用,一、数据处理 受体放射分析所得测定数据都是放射性单位，如cpm，dpm等，而受体分析没有标准品，不能通过标准曲线得到所需结果，只能靠数据换算来解决。如换算成每毫克蛋白或106细胞所含受体数（通常以fmol或受体分子数表示）或平衡解离常数（通常以nmol/L表示）。另外，较多的受体放射分析是各种多点法，实验得到的是若干点的实测值，需要经过用一定的数学模型进行直线或曲线拟合，才能得到所要的结果。所以受体放射分析的数据处理包括两个方面，一是正确的单位换算，二是各种手工或计算机的数据拟合。,二、 RBA应用的几个主要方面,1在内
23、分泌学和神经生理方面：通过RBA证明，几乎所有的激素和神经递质都通过特定的受体发挥作用。一些激素和递质影响细胞代谢和功能的机制现正通过RBA和其它指标（如酶活力、基因表达）的综合观察得到新的认识。2在药理学及药物筛选方面：RBA是研究药物作用原理的重要手段，包括药物作用部位、协同作用和拮抗作用的机制竞争性RBA为比较不同药物的作用和寻找更有效的新药提供了一种极有用的手段，在受体亚型的研究中更是不可缺少的技术。,3免疫学方面：正在用RBA逐步证明，免疫细胞表面存在能识别各种特异性和非特异性免疫刺激剂的受体，这是研究免疫调节机制的关键性环节之一。4在病理学和临床医学方面：受体的研究更受到很大注意，RBA已提供一些重要证据，说明有些疾病的发生发展与受体变化直接有关。5近年来我国科学家在中西医结合的研究中也开始注意受体这一环节6八十年代以来，受体研究的一个重要趋势是设法纯化各种受体蛋白，以探讨受体的本质及受体与配基相互作用的分子生物学基础。,
