1、荧光定量PCR技术在临床检测中的应用,黄少军 市中心医院,PCR与基因诊断技术,基因诊断即通过核酸的分子生物学检测直接检测基因的存在状态或缺陷对疾病作出诊断的方法。Polymerase chain reaction(PCR)，聚合酶链式反应，是一种DNA的快速扩增技术。PCR技术通过两个短的称为引物的DNA小片段和一种耐热酶的作用，可在3个小时内把特定的DNA片段扩增1000万倍。 九十年代中期PCR临床应用在国内全面开展，1998年，荧光定量PCR技术开始在中国应用于临床检测。,4 基因诊断,3 免疫学诊断,临床诊断,细胞膜,细胞核,DNA,转录,mRNA,翻译,蛋白质,1 形态学诊断,2
2、生化诊断,概念,基本原理,以DNA为例（1）DNA变性：（2）降温退火：（3）引物延伸：,原理 第一步 加热变性,预处理,第二步 引物与靶序列退火,第三步 - 引物延伸,第1个 PCR 循环完成后 得到两个拷贝的靶序列,PCRPCR.exe动画,30次循环后靶序列扩增的数量,No. ofNo. Amplicon CyclesCopies of Target122438416532664201,048,576301,073,741,824,荧光PCR的原理,PCR技术的特点,灵敏度高 特异性强 快速简便 应用范围广,Ct值的意义,Ct值与重复性同一样本在相同条件下同时进行96次扩增,FQ-PCR
3、,Ct值与浓度不同的模板达到荧光域值时的Ct值不同,感染性疾病的诊断 母婴传播的控制与观察 遗传疾病的诊断 肿瘤的诊断 法医学鉴定,荧光定量PCR的临床应用,早期诊断 病情评估和预后判断 抗病毒药物疗效的观察、指导 新药验证,一 感染性疾病 1. 病原体含量与病情之间的关系 2. 病原体含量与用药之间的关系 3. 药物及疗法的研究与开发 4. 新的病原体分子诊断标准 5. 新的愈后指标 6. 传染病发病的监控、预测与预防,临床应用,临床应用,二 肿瘤1. 肿瘤标志物：癌胚抗原、同功酶、抗体、激素、细胞因子、受体等2. 肿瘤相关基因表达的检测：包括癌基因抗癌基因、肿瘤转移基因及转移抑制基因,三
4、遗传病1. 等位基因检测2. 多基因遗传病的突变检测3. 基因表达异常所致遗传病检测,1.亲子鉴定 2.法医物证 3.PCR-RFLP技术的法医学应用 4.罪犯鉴定,法医鉴定,免疫学诊断主要是抗原抗体反应，应用于临床通常在体内产生抗体以后，而许多病原体的免疫学检测存在较长的“窗口期”，不利于对疾病的早期诊断；PCR方法直接检测病原体的DNA/RNA，能大大缩短“窗口期”，其高灵敏度的检测显然也有利于疾病的早期诊断。,疾病的早期诊断,荧光定量PCR在病原体检测中的应用,一 肝炎病毒定量检测二 性病病原体检测三 结核杆菌及呼吸道病原体检测四 优生优育(TORCH)相关项目检测,临床应用,肝炎病毒定
5、量检测HBVHCV,临床应用,（一） 乙型肝炎病毒结构及特点,HBsAg：是HBV感染的主要标志HBsAb：保护性抗体HBcAg：仅存于感染的肝细胞核内，一般不存在于血循环中HBcAb: 非保护性抗体，HBcAb-IgM提示HBV处于复制状态HBeAg：HBV复制及强感染性的指标HBeAb：有一定的保护作用，预后良好,HBV,HBV,（二） HBV-DNA与“两对半”,1. “两对半” ：机体的免疫反应状态；,2. “携带者”、“大三阳”、“小三阳”等免疫学指标不能 反应体内病毒复制水平与感染程度。,FQ-PCR：检测的是HBV本身的遗传物质DNA，是 病毒存在和复制的最可靠、最直接的指标。,
6、3. 血清学指标()不能排除HBV感染。,HBV,（二） HBV-DNA与“两对半”,4. 也可能出现HBsAg()，HBV-DNA()。,5. HBsAb () 、 HBcAb () 、 HBeAb ()三抗体阳性 与HBV DNA 2.5 103 copy /ml 结果解释。,HBV,(三)HBV-DNA定量检测的临床意义,3. HBV-DNA定量与预后 a. 含量高者急性肝炎患者易慢性化 b. 癌变的几率明显高于含量低者,1. HBV-DNA定量与HBV复制水平及传染性,2. HBV-DNA定量与乙肝药物疗效 a. 专家提出103 copy /ml做为阴性或临床治愈标准 b. HBV-D
7、NA定量分析与干扰素治疗(前、中、后) c. 拉咪呋啶,HBV,(三)HBV-DNA定量检测的临床意义,4. HBV-DNA定量有助于指导怀孕与孕期，哺乳期检查,6. 血液制品和献血员的筛选,HBV DNA检测的临床意义,HBV DNA是HBV存在最直接的依据HBV DNA是HBV复制的标志HBV DNA是患者具有传染性的标志HBV DNA对乙肝两对半起补充作用HBV DNA是目前判断乙肝抗病毒药物疗效最敏感的指标HBV DNA可检测出隐匿性慢性乙型肝炎,病毒特点： 1. 单正链RNA病毒 2. E1和E2区基因高度变异性,（一）丙型肝炎病毒特点,HCV,感染特点：HCV在血中含量极微 输血后
8、肝炎主要致病因子免疫学标志仅有抗-HCV，非中和抗体，产生时间不一有一部分人感染HCV后，不产生抗-HCV 感染易于慢性化(50-85%)疫苗研制尚不成功,单链RNA,(二)HCV-RNA定量检测的临床意义,1. 早期诊断 a. 临床以多少？，多少？具体值？,举例,例如：试剂盒检测范围是103108IU/ml,我们测定的阴性结果应报告 103 IU/ml；（无、含量低）。中间值报告具体数据；当含量高于最高检测限时，报告108 IU/ml。（ 108 IU/ml； 109 IU/ml .） 参考范围?,IU/ml与COP/mlD的换算-咨询厂家 3.5E+05 IU/ml-表示一毫升血清中有35
9、0，000个HBV病毒微粒。,HBVDNA的变化,在患者治疗过程中检测HBVDNA定量，一般认为：其结果相差5倍属正常波动，结果相差降低10倍以上才算治疗有效。,例如1,有一患者治疗前检测HBV-DNA定量为8.8E+06 IU/ml，治疗一月后复查为2.3E+07 IU/ml，两结果相差2.6倍。（不一定是高了？）如何向病人解释：属正常波动或者检测误差（允许误差）,例如2,一患者治疗前检测HBV-DNA定量为9.2E+06 IU/ml；治疗一月后复查为2.8E+06 IU/ml，两结果相差3.3倍，不能说明治疗有效，需要继续观察。要有明显的下降趋势。,检验报告单结果读取,3.637E+06 检测下限: 1000拷贝/毫升3.637106 1.000E+03 copy/ml,如果是标本量是可以定量的，如血液、脑脊液等，则检测结果报告为：copy/ml如果是标本量不能定量，如分泌物等，则结果只能报告为：copy,Thank You !,
