1、2 发酵液的预处理和固液分离Chapter 2 Pretreatment and solid-liquid separation of broth,2.1 发酵液的预处理2.2 发酵液的固液分离2.3 细胞破碎,待处理杂质的影响,金属离子粘稠物蛋白质,2.1.1.1 发酵液杂质的去除,1. 无机离子的去除(首先考虑：离子交换法),Ca2+,Mg2+,Fe2+,草酸、草酸钠，形成草酸钙沉淀（注意回收草酸） ；,三聚磷酸钠，形成三聚磷酸钠镁可溶性络合物；,4Fe3+3K4Fe(CN)6Fe4Fe(CN)63+ 12K+,黄血盐，普鲁士蓝沉淀,Fe3+,赤血盐，滕氏蓝沉淀,3Fe2+2K3Fe(CN
2、)6Fe3Fe(CN)62+ 6K+,2. 蛋白质的去除,（1）Savage去除蛋白质（蛋白质处于两相之间） 正丁醇：氯仿=1：4（5）该法条件温和，可避免多糖的降解，但除蛋白质效率低。,（2）三氯乙酸去除蛋白质向多糖溶液加入1/5体积10%的三氯乙酸溶液磁力搅拌30 min，离心去除沉淀。缺点是易引起某些多糖的降解。,在280nm出测定光吸收值,（3）蛋白质酶去除蛋白质,2.1.1.2 改善培养液的性能,（1）加热法 除去某些热敏性杂蛋白，降低黏度，有利过滤（如糖液热过滤）。取决于产品的热稳定性、能耗。一般加热65-80。,（2）调节pH值,（3）凝聚和絮凝凝聚：中和电荷，通常细菌的表面都带
3、有负电荷工业上常用阳离子型。无机盐类 ：Al2(SO4)3，KAl(SO4)218H2O, Fe2(SO4)3，FeSO4，ZnSO4, AlCl3, ZnCl2金属氢氧化物或氧化物 ： Fe(OH)3, Al(OH)3, Ca(OH)2；CaO等高价金属。,絮凝絮凝剂是一种能溶于水的高分子聚合物，其相对分子质量可高达数万至一千万以上，长链状结构，其链节上含有许多活性官能团，包括带电荷的阴离子（如COOH）或阳离子（如NH2）基团以及不带电荷的非离子型基团。它们通过静电引力、范德华引力或氢键的作用，强烈地吸附在胶粒的表面。,絮凝剂种类,阴离子型阳离子型非离子型,聚丙烯酸钠（无毒，食品医药可用）
4、和聚苯乙烯磺酸,聚丙烯酸二烷基胺乙酯和聚二丙基四胺盐,聚氧化乙烯,聚丙烯酰胺,聚丙烯酰胺（PAM）是目前工业应用最广泛的高分子絮凝剂之一。阴、阳、两性、非离子型：分别用阴、阳、非离子单体和丙烯酰胺共聚而成的线形离分子聚合物。优点：种类多，用量少，ppm级，絮凝体粗大，效果好，速度快。缺点：聚丙烯酰胺本身无毒，但是其单体有毒。特别是阳离子型，食品医药谨用。,食品和医药工业常用絮凝剂,阴离子型：聚丙烯酸钠（无毒，食品医药可用）和聚苯乙烯磺酸；无机高分子聚合物絮凝剂：聚合铝盐、聚合铁盐；天然有机高分子絮凝剂：丹宁，明胶，壳聚糖。,聚合氯化铁,2.1.2 发酵液的固液分离,重力沉降浮选双水相萃取微孔过
5、滤：固液相分离不完全，浓缩液中 70-80%水（常规过滤固相含水30-40%）,工业上常用,过滤离心,2.1.2.1 过滤,（1） 影响过滤速度的因素菌种发酵条件,真菌,细菌,放线菌,菌种对过滤的影响,：菌丝粗，易过滤，不需特殊处理，可用真空转筒过滤机。如青霉菌的菌丝直径可达10m。 ：菌丝细而分支，交织成网络状，过滤困难，一般须预处理。链霉素菌丝：0.5-1.0m。（抗生素约70%是放线菌产生） ：菌体更细小，过滤十分困难，如不用絮凝等方法预处理，很难用过滤和分离法操作。 0.55m,真菌,放线菌,细菌,过滤助剂,过滤助剂可解决两个问题滤饼的可压缩性问题小粒子如菌丝碎片和细菌细胞，会渗入到转
6、鼓真空过滤预覆盖层内部，堵塞部分孔。常用的过滤助剂 硅藻土、珍珠岩、活性白土,助滤剂两种加入方法,预先铺一层助滤剂(12mm),助滤剂用量等于悬浮液中固体含量,（2） 过滤设备,板框过滤机真空转鼓过滤机加压叶滤机带式过滤机袋式过滤机,板框过滤机,板框过滤机,优点板框压滤机的过滤面积大；过滤推动力(压力差)能较大幅度地进行调整，并能耐受较高的压力差；结构简单，价格低；动力消耗少等优点。缺点不能连续操作，设备笨重，劳动强度大；卫生条件差；非生产的辅助时间长，阻碍了过滤效率的提高。,真空转鼓过滤机,优点：能连续操作，能实现自动化控制缺点：压差较小，主要适用于霉菌发酵液的过滤。,带式压滤机,PBF系列
7、连续水平真空带式过滤机,紧凑带式过滤机,加压叶滤机（立式）,适合于固体含量少于0.1%,2.1.2.2 离心,优点：分离速度快，分离效率高、液相澄清度好，操作时卫生条件好；缺点：设备投资高、能耗大。,表2.3 离心机的种类和适用范围,离心力计算,离心转速r=5000 r/min，半径R=30 cm，离心力？gZg=8385gZ=1.11810-5(r)2R,超离心法,分为：差速离心，区带离心。差速离心(differential centrifugation) 主要是采取逐渐提高离心速度的方法分离不同大小的细胞器。,区带离心（Zonal centrifugation）,密度梯度制作：先调配不同浓
8、度（密度）的蔗糖溶液，然后在离心管中以浓度从大到小层层加入即可。将一定浓度的蔗糖溶液经一定时间的高速离心后可制成连续的蔗糖密度梯度。CsCl 和NaBr在离心力的作用下可自动形成密度梯度。,三足式离心机,碟片式离心机,管式离心机,2.2 细胞破碎,胞内产物：胞内酶（青霉素酰化酶，碱性磷酸酯酶），脂类，甾族化合物（萃取法提取），遗传工程菌生产的蛋白质及某些抗生素。,图2.8 真核细胞结构示意图,细胞壁,叶绿体,高尔基体,线粒体,核糖体,内质网,核,细胞膜,2.2.1 细胞的结构,动物、植物和微生物细胞的结构相差很大。,生物细胞,图2.9 细胞破碎机理,2.2.3 细胞破碎技术,2.2.3.1 机
9、械破碎高压匀浆器 球磨机超声波破碎非机械方法 ：辅助方法2.2.3.2 化学和生物化学渗透（1）酸碱处理；（2）化学试剂处理；（3）酶溶2.2.3.3 物理渗透法（1）渗透压冲击；（2）冻结-融化法,工业上常用,实验室常用,2.2.3.1 机械破碎,（1）高压匀浆法,细胞悬浮液,细胞匀浆液,碰撞环,图2.11 高压匀浆器结构简图,阀,阀座,破碎原理： 细胞悬浮液在高压作用下从阀座与阀之间的环隙高速（可达450m/s)喷出后撞击到碰撞环上，细胞在受到高速撞击作用后，急剧释放到低压环境，从而在撞击力和剪切力等综合作用下破碎。操作压力通常为50-70MPa。,团状或丝状真菌：堵塞 较小的革兰氏阳性菌
10、：太小 含有包含体的基因工程菌：太坚硬,不宜采用高压匀浆法的细胞类型,（2）球磨法,球磨机 研磨是常用的一种方法，它将细胞悬浮液与玻璃小珠或氧化锆一起快速搅拌或研磨，使达到细胞的某种程度破碎。这些装置的主要缺点是在破碎期间样品温度迅速升高，通过用二氧化碳来冷却容器可得到部分解决。 微珠填充率是细胞的80-85%，微珠与目标细胞的直径比30-100之间。,细胞悬浮液,微珠,冷却剂,冷却剂,细胞匀浆液,搅拌桨,液珠分离器,图2.13 珠磨机结构简图,玻璃珠,氧化锆,实验室规模的细胞破碎设备有Mickle高速组织捣碎机、 Braun匀浆器；中试规模的细胞破碎可采用胶体磨处理；在工业规模中，可采用高速
11、珠磨机（瑞士WAB公司和德国西门子机械公司制造）。,珠磨法的破碎率一般控制在80%以下。珠磨法适用于细胞悬浮液和植物细胞的大规模处理。,胶体磨,德国进口珠磨机（立式）,高速组织捣碎机,细胞的破碎是由于超声波的空穴作用，从而产生一个极为强烈的冲击波压力，由它引起的粘滞性旋涡在介质中的悬浮细胞上造成了剪切应力，促使细胞内液体发生流动，从而使细胞破碎。 特点 超声波破碎法是很强烈的破碎方法，适用于多数微生物的破碎。一般杆菌比球菌易破碎，G-细菌比G+细菌易破碎，对酵母菌的效果较差。该法在实验室小规模细胞破碎中常用。,（3）超声波法,超声波破碎仪,2.2.3.2 化学和生物化学渗透,酸碱处理 可以使蛋
12、白质水解，细胞溶解或使某些组分从细胞内渗漏出来。化学试剂处理 表面活性剂：十二烷基磺酸钠（SDS)，Triton X-100,十四烷基胺盐(CTAB); 螯合剂：乙二胺四乙酸（EDTA），与金属离子结合，如阴性菌外层Mg2+、Ca2+处理的方法; 有机溶剂:如苯、甲苯、丁醇、丙酮、氯仿及尿素。这些试剂容易引起生化物质破坏，还会带来分离和回收化学物质的问题。,酶溶法,利用酶反应，分解破坏细胞壁上特殊的键，从而达到破壁的目的。优点：专一性强，发生酶解的条件温和。缺点：酶水解费用较贵，一般只适用于小规模的实验室研究。,（1）细菌：溶菌酶lysozyme 革兰氏阳性菌：溶菌酶 革兰氏阴性菌：溶菌酶+E
13、DTA（破坏脂多糖）（2）酵母：Zymolyase，葡聚糖酶或甘露糖酶（3）植物细胞壁：纤维素酶可将化学法与机械法结合起来。溶菌酶、多糖水解酶预处理面包酵母，然后高压匀浆法处理6次，破碎率95%以上。,另一种酶解方法，溶胞酶是由微生物本身产生的。影响自溶过程的因素有温度、时间、pH缓冲液浓度、细胞代谢途径等。例 酵母4550，保温20小时。 谷氨酸菌：加0.028M Na2CO3和0.018MNaOH，pH10，3%悬浮液，加热至70，保温搅拌20min，自溶。特点 自溶法在一定程度上能用于工业规模，但是，对不稳定的微生物容易引起所需蛋白质的变性，自溶后的细胞培养液过滤速度也会降低。,自溶作用
14、,干燥法,热空气干燥：适用于酵母，25-35热空气吹干后的酵母有部分自溶，然后用水、缓冲溶液或其它溶剂抽提。真空干燥：适用于细菌。冷冻干燥：适用于不稳定的生化物质，将冷冻干燥后的菌体在冷冻条件下磨成粉，然后用缓冲溶液抽提。一般配成10-40%的菌悬液进行冷冻干燥，经冻干后的细胞渗透性能大大变化，便于抽提。,2.2.3.3 物理渗透法,（1）渗透压冲击（Osmotic shock）是较温和的一种破碎方法，将细胞放在高渗透压的介质中(如一定浓度的甘油或蔗糖溶液)，达到平衡后，介质被突然稀释，或者将细胞转入水或缓冲液中，由于渗透压的突然变化，水迅速进入细胞内，引起细胞壁的破裂。 特点 渗透压冲击的方
15、法仅对细胞壁较脆弱的菌，或者细胞壁预先用酶处理，或合成受抑制而强度减弱时才是合适的。如：动物细胞，革兰氏阴性菌。,（2）冻结-融化法（反复冻融法）,将细胞放在低温下突然冷冻和室温下融化，反复多次而达到破壁作用。 冰冻使膜的疏水键结构（双脂质和蛋白质组成）裂开，增加了细胞亲水性，另外胞内冰粒是细胞溶胀。 特点 对于细胞壁较脆弱的菌体，可采用此法。但通常破碎率很低，即使反复循环多次也不能提高收率。另外，还可能引起对冻融敏感的某些蛋白质的变性。,细胞破碎技术研究的发展方向,多种破碎方法相结合。与上游过程相结合：发酵过程中，培养剂、生长期、操作参数（如pH值、温度、通气量、稀释率）等因素对细胞破碎都有影响。因此细胞破碎与上游培养有关。与下游过程相结合：细胞破碎与固-液分离紧密相关，对于可溶性产品而言，碎片必须除净，否则造成层析柱和超滤膜的堵塞，缩短设备使用寿命。,
