1、DNA 限制性内切酶消化实验原理 限制性内切酶： 识别回文序列，产生粘性或平性末端，具有相同粘性或平性末端的不同 DNA片段可连接起来形成重组 DNA分子，故 DNA限制性内切酶是分子生物学实验中重要的工具酶。 影响酶活性的因素有很多，温度、 pH值、离子强度、激活剂或抑制剂等都影响酶的酶切活性实验原理 每种酶有其最适的缓冲体系（低盐、中盐、高盐等） 单酶切反应 双酶切反应酶反应体系： 底物 DNA限制性内切酶： 1-5U/gDNApHTRis-HCl缓 冲液小牛血清白蛋白NaCl温度 :37时间 ： 1-2h实验步骤pBR322 2 lPst 2 lEcoR 2 l10Buffer 2 ld
2、dH2O 12 l总 体 积 20 l封口膜封口 ,瞬时离心37 水浴， 2h65 加热灭活终止反应冰水浴DNA琼脂糖凝胶电泳 原理：琼脂糖凝胶电泳通过电荷效应和分子筛效应分离不同分子量大小的 DNA，相同分子量的 DNA分子若构型不同电泳速度亦不同。 琼脂糖凝胶电泳是分离、纯化、鉴定DNA片段的典型方法，特点是制备简单、快捷，灵敏 溴化乙锭为荧光染料，可插入DNA双螺旋结构的两个碱基之间，与与核酸结合成荧光复合物，在紫外线254 365nm照射下呈桔红色荧光。电泳时所需 DNA样品量仅 0.5 1g .线性 DNA片段分离的有效范围与琼脂糖凝胶浓度的关系琼 脂糖凝胶的百分 浓 度 分离 线 性 DNA片段分离的有效范 围 (kb)0.3 60 50.6 20 10.7 10 0.80.9 7 0.51.2 6 0.41.5 4 0.22.0 3 0.1实验步骤 琼脂糖溶液的制备溴化乙锭浓度 0.5 g/mL 凝胶板的制备 上样 电泳电压 10v/cm,溴酚蓝移出 2/3的距离时，取出凝胶紫外灯下观察结果
