1、特定蛋白的免疫测定及临床意义卫生部临床检验中心 李金明特定蛋白的免疫测定方法n 基本原理：免疫沉淀反应免疫透射比浊免疫散射比浊免疫沉淀反应的发展历史n 1897年， Kraus发现细菌培养液与其相应抗血清混合后出现肉眼可见的沉淀反应 n 1902年 Ascoli建立了环状沉淀试验。n 1905年 Bechhold将抗体混溶在明胶中，然后再将相应特异抗原加于其上，抗原抗体的特异结合可在明胶中出现沉淀。n 1946年 Oudin报道了试管单向免疫扩散试验。（ 1965年Mancini又提出了平板单向免疫扩散试验。）n Grabar和 Williams在 1953年报道了免疫电泳。（对流免疫电泳、火
2、箭免疫电泳和免疫固定电泳）n 上述为经典免疫沉淀试验发展阶段，测定范围窄（ 10 100 g/ml）、 灵敏度低，繁琐费时，不能自动化。免疫沉淀反应的发展历史n 1959年， Schultze等报道了透射比浊法（Transmission turbidimetry)。n 1967年， Ritchie等报道了散射比浊法(nephelometry)。n 1977年， Sternberg等进一步发展建立了速率散射比浊法 (Rate nephelometry)。n 免疫比浊测定方法与免疫沉淀方法相比，灵敏度高，重复性好，测定范围宽，已用于临床体液特定蛋白含量的测定，现已有多种自动化检测仪器应用于临床检验
3、，尤其是免疫散射比浊测定。免疫透射比浊n 基本原理：一定波长光线通过抗原抗体反应混合液时，被其中的免疫复合物（ IC） 反射或遮挡、吸收而减弱。在一定范围内，透射光被吸收的量与免疫复合物的量呈正比，后者又与相应抗原和抗体的量呈函数关系。抗体量一定，即可从标准曲线获知抗原的量。n 由于要求抗原抗体复合物的数量足够，并且颗粒要足够大（ 35100nm）， 本法的测定灵敏度和准确度相对较低。免疫散射比浊n 基本原理：光线通过检测溶液时，被其中所含的抗原抗体复合物折射而部分偏转，产生散射光。根据雷利散射公式，在一定条件下，透射光与微粒浓度成正比，散射光与微粒浓度成反比。n 散射比浊可分为 终点 和 速
4、率 散射比浊两种。n 光源荧光：高压汞灯发射，入射光波长（ ） 355nm，散射夹角（ ）为 90激光：氦氖灯， =663nm， =1535碘钨光：碘钨灯， =400500nm， =70影响免疫比浊测定的主要因素n 抗原、抗体比例与浊度关系：抗原过量，出现“带现象 ”， IC分子小，且可发生再解离，浊度下降，光散射减少。抗体过量， IC形成随抗原量增加到抗原抗体最适比例时达高峰。抗体须过量但又必须适量，抗体浓度是测定关键。影响免疫比浊测定的主要因素n 抗体质量：特异性、效价、亲和力、 R型抗体高亲和性抗体的抗原结合点与抗原表位的空间构型上非常适合，两者结合牢固，不容易解离。反之，低亲和性抗体与
5、抗原形成的复合物较易解离。 R型抗体以家兔免疫血清为代表，具有较宽的抗原抗体合适比例范围，只在抗原过量时，才易出现溶性免疫复合物，大多数动物的免疫血均属此型。 H型抗体以马免疫血清为代表，其抗原与抗体的合适比例范围较窄，抗原或抗体过量，均可形成可溶性免疫复合物。人和许多大动物的抗血清皆属 H型。 影响免疫比浊测定的主要因素n 反应溶液： pH6.58.5，适当浓度电解质（中和抗原抗体复合物表面电荷，促进凝聚）、离子强度（大， IC形成快）；一般常用磷酸盐缓冲液。n 增浊剂：非离子型亲水剂如聚乙二醇（ PEG）、吐温 -20等，以 PEG6000最好，浓度一般为 3%4%。浓度过高可致非特异沉淀。特定蛋白测定的质量控制n室内质量控制n室间质量评价
