1、,遗传变异的物质基础微生物的遗传物质基因突变基因的转移与重组菌种选育和保藏,Gene（基因）,基因（gene） DNA分子中含有特定遗传信息的一段核苷酸序列，是遗传物质的最小功能单位。基因组（genome） 一个物种的单倍体的所有染色体及其所包含的遗传信息的总称。 基因型（genotype） 生物的全部遗传因子。 表型（phenotype） 与基因型相对，是生物在特定条件下表现出来的全部性状。表型是由基因型所决定，但也和环境有关。,突变（mutation） DNA或RNA中核苷酸序列发生了稳定可遗传的变化，导致生物的部分性状发生可遗传的变异。 基因突变：DNA链上一对或少数几对碱基发生置换、缺
2、失或插入引起的突变，涉及范围小，又称点突变（Point Mutations） 。 染色体畸变：大段染色体的缺失、重复、异位和倒位，即较大范围内遗传物质结构的改变。,The three major single chromosome mutations 1.deletion； 2.duplication；3.inversion,基因突变 (gene mutation),表型饰变 (phenotypic modification),不同环境下相同基因型的微生物表现出不同的表型，是暂时的，非遗传性的改变。 eg.0.1%石炭酸抑制变形杆菌的鞭毛生长,普通琼脂培养基,0.1%石炭酸培养基,粘质沙雷菌,
3、基因突变的基本特点,自发性和不对应性稀少性 ( 突变率10-6-10-9 )可诱发性独立性稳定可遗传性可逆性 野生型菌株、突变株 (Wild type 、 mutant) 回复突变,基因突变的自发性和不对应性,判断下面表述是否正确：抗药性突变是由于接触了药物所引起的。抗噬菌体的突变是由于接触了噬菌体所引起的。抗紫外线的突变是由于接触了紫外线所引起的。,突变的性状与引起突变的原因间没有直接的对应关系!,如何证明基因突变的非对应性？,三个经典实验,变量实验、涂布实验、影印实验,变量实验Salvador Luria and Max Delbruck（1943）,Salvador Luria,Max
4、Delbruck,The Nobel Prize in Physiology or Medicine 1969,Newcombe的涂布实验（1949）,影印实验Joshua Lederberg and Esther Lederberg（1952）,J. Lederberg is awarded the Noble Prize in Medicine and Physiology in 1958,Joshua Lederberg,以上实验证明 基因突变的非对应性即：突变的性状与引起突变的原因间没有直接的对应关系！,1）营养缺陷型（auxotroph）：微生物经突变后失去对某种生长因子（维生素、氨
5、基酸、核苷酸等）的合成能力，必须依靠外界供应才能生长，这种突变株称为营养缺陷型。表示方法：基因型：前三个英文，小写，斜体如：hisC 表示组氨酸缺陷型，其中的大写字母C表示同一表型中不同基因的突变）表型：同上，但第一个字母大写，且不用斜体：HisChisC-和hisC+ ，分别表示组氨酸缺陷型和野生型。,在选择培养基（一般为基本培养基）上不生长,在完全培养基上可以生长，为负选择标记。 微生物遗传学研究中重要的选择标记和育种的重要手段。,突变株的类型及实际应用,Ames Test,美国加利福尼亚大学的Bruce Ames教授于1966年发明，用于检测某种新药是否具有诱变和致癌作用。,“生物化学统
6、一性”法则： 人和微生物在DNA的结构及特性方面是一致的，能使微生物发生突变的诱变剂必然也会作用于人的DNA，使其发生突变，最后造成癌变或其他不良后果。,诱变剂的共性原则：化学药剂对细菌的诱变率与其对动物的致癌性成正比。超过95%的致癌物质对微生物有诱变作用，90%以上的非致癌物质对微生物没有诱变作用。,诱变剂与致癌物质,试验菌株特征：具有不同的、经遗传学确证的组氨酸营养缺陷；细胞壁组成（脂多糖）缺陷，对有机化合物有高度渗透性；DNA切除修复功能缺陷回复突变(reverse mutation/back mutation)：突变体失去的野生型性状，可以通过第二次突变得到恢复，这种第二次突变称为回
7、复突变。,Ames Test,具体操作：检测鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhmurium)组氨酸营养缺陷型菌株(his-)的回复突变率,Ames test,证明Ames试验重要性的应用实例：,国外曾开发了一种降低妇女妊娠反应的药物“反应停”，由于其药效显著，在20世纪60-70年代十分流行，但随后人们就发现畸形儿的出生率明显增高，而且生产畸形儿的妇女大多曾服用“反应停”，后来采用Ames试验发现这种物质的确具有很强的致突变作用，因此这种药物被禁止使用但如果能在这种药物上市之前就进行Ames试验检测，那么这种大量出生畸形儿的悲剧完全可以避免。,3）抗性突变型（resistant m
8、utant）,分为抗药性、抗噬菌体和抗紫外线等。抗药性：细菌对某种抗菌药物敏感性降低或产生耐药性，是遗传学研究中重要的选择性标记。正选择标记（突变株可直接从抗性平板上获得）表示方法：所抗药物的前三个小写、斜体、英文字母加上“r” strr 和 strs 分别表示对链霉素的抗性和敏感性,2） 高产突变株正变株：产量提高 负变株：产量降低,4）条件致死突变型（conditional lethal mutant）,在某一条件下具有致死效应，而在另一条件下没有致死效应的突变型。负选择标记如温度敏感突变型（Ts，temperature sensitive mutant ）, 在高温下(如42)是致死的，
9、可以在低温(如25-30)下得到这种突变。 常被用来分离生长繁殖必需的突变基因。,5）形态、结构、毒力的变异,胆汁、甘油、马铃薯培养基牛型结核杆菌 卡介苗 13年 ( 230代 ) (BCG) Calmette-Guerin 疫苗 生物武器,自发突变（spotaneous mutation） 没有人工参与下生物体自然发生的突变，一般频率较低，通常为10-6-10-9 。机制：环境因素的诱变碱基结构的变化：如T和G酮式和烯醇式构型的互变, C与A氨基式和亚氨式构型的互变,导致ATGC或GCAT的置换。环出效应转座效应,基因突变的分子机制,诱变 (mutagenesis) 人为用理化因素诱导生物体
10、遗传物质发生变异，突变以较高的频率产生。 诱变剂（mutagen）：能提高突变率的任何理化因子。诱变机制：碱基置换、移码突变、插入或缺失,基因突变的分子机制,1、碱基置换（Base-pair substitution ）DNA复制中，一对碱基被另一对碱基取代，造成配对错误。包括转换（transition）和颠换（transversion）,5-溴尿嘧啶(5-BU)引起的突变,5-BU是胸腺嘧啶的代谢类似物,腺嘌呤脱氨成次黄嘌呤,2、移码突变（Frame Shift Mutation）：DNA分子中一对或少数几对核苷酸的增加或缺失而造成的基因突变。,紫外线的诱变机制,UV导致DNA分子链上氢键的
11、断裂、磷酸-戊糖骨架断裂、嘧啶的水合作用、胸腺嘧啶二聚体的形成(包括链间或链内)。,DNA损伤的修复,光复活作用（photoreactivation） 将经紫外线照射后的细胞立即暴露在可见光下时，可明显降低其死亡率，称光复活作用。 光复活酶在黑暗中专一地识别嘧啶二聚体并与之结合，形成酶-DNA复合物，该酶可利用可见光能将二聚体解体，使DNA损伤得到修复。,遗传变异的物质基础微生物的遗传物质基因突变基因的转移与重组菌种选育和保藏,基因的转移和重组,基因重组（genetic recombination）： 两个不同个体内的遗传基因通过重新组合，形成新遗传型个体的方法。重组子（recombinant
12、）：经基因重组后形成的有新遗传特性的细胞。,基因重组的主要方式转化接合转导原生质体融合,转化（transformation）- 受体菌接受供体菌裸露的DNA片段，从而获得供体菌部分遗传性状的过程。转化子（ transformant ）：转化后能稳定表达供体菌部分遗传性状的重组子。, 1928年Griffith首先进行了细菌转化试验。 1944年Avery利用转化试验证实了DNA是遗传的物质基础。,转化的条件（1）外源DNA片段 双链DNA，大小（MW为106108） 同源性（一般30%以上即认为同源性较高） DNA纯度（2）受体菌的生理状态 感受态(competence)： 受体菌能够从周围环
13、境中吸收外源 DNA 分子进行转化的生理状态。感受态细胞: 具有摄取外源DNA能力的细胞与菌的特异性，生长期及培养条件有关； Ca2+、Mg2+；,自然转化；人工诱导（CaCl2）；原生质体转化(PEG)；电转化,转化过程,主要通过 3 个步骤完成。 1、感受态细胞 ：CaCl2 处理 2、DNA 的结合和摄取 供体双链 DNA 与受体细胞壁上的接受位点相结合，随后其中一条链被内切核酸酶降解，降解产生的能量把另一条链推进受体细胞。 3、 转化因子与染色体重组 当单链DNA进入受体细胞后，与受体染色体 DNA 同源片段发生交换重组，形成供体 DNA- 受体 DNA 复合物，再通过错配修复或DNA
14、 复制和细胞分裂形成转化子。,基因重组的主要方式转化接合转导原生质体融合,接合(conjugation),供体菌和受体菌通过细胞与细胞的直接接触，遗传物质自供体菌转移入受体菌，使后者获得前者的部分遗传性状，这种基因转移方式称为接合。,F质粒结构复制和不相容区转移区插入区（重组区）,F plasmid,F因子的存在方式及E.coli的四种接合型菌株,F+,F+,F+,+,F+,F+,F+,+,Hfr,F-,Hfr,+,F,F,F,+,Hfr菌株与F-菌株接合时，能带动细菌染色体转移入F-菌株，并以很高频率与受体菌染色体重组，由此而得名为高频重组菌株（high frequency of recom
15、bination strain ，Hfr strain）。Hfr菌株内的F因子因不正常切割而脱离染色体时，形成游离的但携带一小段染色体基因的F因子，特称为F因子。通过F因子的转移而使受体菌改变遗传性状的现象称为F因子转导（F-duction）或性导（sexduction）。,基因重组的主要方式转化接合转导原生质体融合,以噬菌体为媒介，将供体菌的DNA片段携带到受体细胞，通过交换与整合，使受体菌获得供体菌的部分遗传性状的基因转移方式。,转导(transduction),能将一个细菌宿主的部分染色体或质粒DNA带到另一个细菌的噬菌体称为转导噬菌体（Transducing phage）.通过转导而获
16、得新遗传性状的受体菌叫转导子（transductant）。转导分为：普遍性转导和局限性转导。,普遍性转导(generalized transduction) 完全缺陷噬菌体将供体菌任意DNA片段转移到受体菌的转导现象。媒介烈性或温和噬菌体。,普遍性转导,完全转导（complete transduction）外源DNA通过与受体细胞染色体的基因重组而形成稳定的转导子,流产转导（abortive transduction）,转导DNA不能进行重组和复制，但其携带的基因可经过转录而得到表达。,特点：在选择培养基平板上形成微小菌落,外源DNA被降解，转导失败。,举例：E.coli 的噬菌体，插入位点两
17、侧为gal和bio基因，不正常切割时可包装入噬菌体外壳，形成缺陷噬菌体，再感染时形成局限性转导。,局限性转导(restricted /specialized transduction)通过部分缺陷的温和噬菌体把供体菌的少数特定基因携带到受体菌并表达。,普遍性转导与局限性转导的区别,溶源转变与转导的不同？,基因重组的主要方式转化接合转导原生质体融合,原生质体融合(protoplast fusion)两种细胞经溶菌酶或青霉素等处理，失去细胞壁成为原生质体后相互融合的过程。,遗传变异的物质基础微生物的遗传物质基因突变基因的转移与重组菌种选育和保藏,菌种保藏,影响因素：低温、干燥、隔绝空气 传代培养保藏法斜面培养、穿刺培养、疱肉培养基培养等（保藏厌氧细菌）液体石蜡保藏法沙土保藏法液氮保藏法 寄主保藏法冷冻干燥保藏法,斜面,液氮罐,超低温冰箱,冻干管,菌悬液/甘油管,液体石蜡,Review,遗传、变异、基因型、表型的概念；微生物的遗传物质；质粒的概念、特点、类型及应用；转座因子的概念及种类基因突变的概念、特点及分子机制；营养缺陷突变株及其应用；基因的转移和重组（转化、接合、转导的概念和过程）菌种保藏的常用方法,Expanding reading,运动改变你我的DNAhttp:/
