1、激光扫描共焦显微镜技术,样品要求原理 功能 在生物医学中的应用,激光扫描共焦显微镜技术及应用,The techniques and application of Confocal Laser Scanning Microscopy北京大学医药卫生分析中心何其华,激光扫描共焦显微镜技术,人眼分辨率：0.2mm光学显微镜分辨率：0.25mm电子显微镜分辨率：0.2nm共焦显微镜分辨率：0.18mm,二、 原理,激光扫描共焦显微镜技术,原理小结:Confocal 利用放置在光源后的照明针孔和放置在检测器前的探测针孔实现点照明和点探测，来自光源的光通过照明针孔发射出的光聚焦在样品焦平面的某个点上，该点
2、所发射的荧光成像在探测针孔上，该点以外的任何发射光均被探测针孔阻挡。照明针孔与探测针孔对被照射点或被探测点来说是共轭的，因此被探测点即共焦点，被探测点所在的平面即共焦平面。计算机以像点的方式将被探测点显示在计算机屏幕上，为了产生一幅完整的图像，由光路中的扫描系统在样品焦平面上扫描，从而产生一幅完整的共焦图像。只要载物台沿着Z轴上下移动，将样品新的一个层面移动到共焦平面上，样品的新层面又成像在显示器上，随着Z轴的不断移动，就可得到样品不同层面连续的光切图像 。,激光扫描共焦显微镜技术,激光扫描共焦显微镜技术,激光扫描共焦显微镜技术,激光扫描共焦显微镜技术,共焦显微镜与传统显微镜的区别1.抑制图像
3、的模糊，获得清晰的图像,激光扫描共焦显微镜技术,共焦显微镜与传统显微镜的区别2. 具有更高的轴向分辨率，并可获取连续光学切片,conventional,confocal,激光扫描共焦显微镜技术,共焦显微镜与传统显微镜的区别3. 增加侧向分辨率,激光扫描共焦显微镜技术,共焦显微镜与传统显微镜的区别4. 由于点对点扫描去除了杂散光的影响,激光扫描共焦显微镜技术,三. 激光扫描共焦显微镜的设计特点:1.点照明2.具有照明pinhole和探测pinhole3.照明pinhole和探测pinhole共轭(共焦), 共焦点即被探测点，被探测点所在的平面为共焦平面4.具有扫描系统 逐点扫描成像 5.具有多个
4、（四个） 荧光通道，可同时探测多个被标记物,激光扫描共焦显微镜技术,技术指标（Leica TCS SP2) : 1. xy分辨率比传统显微镜小1.4x 传统显微镜: Rxy=0.61/NA （0.25 m ) Confocal: Rxy=0.4/NA（0.18 m )2. 样品的最大厚度: 取决于: 物镜的NA、物镜的工作距离 激光的穿透力、样品的透明度 Z轴的最大移动范围(166m、Z-wide)3. 样品的最小光切厚度: (载物台最小移动距离为40nm） 取决于: 物镜的NA、针孔大小 Z轴的最小移动步距: 40nm Z轴的分辨率: 0.35 m,激光扫描共焦显微镜技术,4. 激光器 Ar
5、激光器: 458nm, 476nm, 488nm, 514nm GreNe : 543nm; HeNe: 633nm Ar激光器(UV): 361nm 激光器的特点: 1) 方向性好: 激光基本延直线传播 2) 单色性好 :=10-8nm 3) 高亮度: 激光方向性好, 其在空间上的能量分布是高度 集中的。 4) 偏振性: 激光为平面偏振光, 光纤耦合,激光扫描共焦显微镜技术,5. 四个荧光通道, 一个透射光通道 即除了可同时采集多标记荧光图像外还可以同时采集透射光图像,但透射光图像为非共焦图像。,激光扫描共焦显微镜技术,6.扫描速度: slow 220lines/s 512512 2-3秒
6、slow2 440lines/s（2：双向扫描） medium 450lines/s 512512 1.7秒 medium2 900lines/s fast 1000lines/s 512512 0.7秒 128128 0.2秒 fast2 2000lines/s7. 扫描密度: 6464 128128 512512 10241024 20482048,激光扫描共焦显微镜技术的应用,The application of Confocal Laser Scanning Microscopy,激光扫描共焦显微镜应用,功能.1.多荧光标记样品的高清晰度、高分辨率图像采集2.无损伤、连续光学切片，显微
7、“CT”3.真正的三维重组4.假三维图的显示5.可沿Z轴（xy平面）和Y轴（xz平面）方向进行光切6.定量分析7.时间序列扫描: xyt 、xyzt 和 xt 扫描8.图像处理9. 旋转扫描10.感兴趣区域扫描11.光谱扫描,激光扫描共焦显微镜应用,应用定位、定量三维重组动态测量 活细胞或组织内游离Ca2+分布和浓度的变化 测量(Mg2+ 、Zn+ 、Na+ 、K+) 自由基的检测 药物进入细胞的动态过程、定位分布及定量 蛋白质的转位,激光扫描共焦显微镜应用,活细胞内H+浓度（ pH值）的测量线粒体膜电位的测量荧光漂白恢复（FRAP）的测量笼锁解笼锁的测量荧光能量共振转移（FRET）的测量其他
8、应用,激光扫描共焦显微镜应用,一、定位、定量免疫荧光标记（单标、双标或三 标）的定位、定量：如：细胞膜受体或抗原的分布， 微丝、微管的分布、 两种或三种蛋 白的共存与共定位、蛋白与细胞器的 共定位、核转录因子转位和干细胞的 增值、分化细胞凋亡: AnnexinV-fitc + PI 末端原位杂交-fitc + PI荧光原位杂交： 染色体基因定位,激光扫描共焦显微镜应用,定位、定量研究中常用荧光探针1.Amine-Reactive Probes 与抗体耦联、与配体耦联、与肽耦联、与人工合成的寡聚核苷酸耦联的探针，可用于免疫组化、荧光原位杂交、受体标记等 Green Red Fura-red FI
9、TC 494/518 TRITC 544/572 Cy5 650/690 (异硫氰基荧光素) (四甲基异硫氰基罗丹明)Alexa Fluor 488 488/530 PE 565/578 (藻红蛋白) Texas Red 595/615 (德州红) Cy3 558/568BODIPY FL 503/512 BODIPY TMR 543/569 BODIPY TR 592/618,激光扫描共焦显微镜应用,1)细胞表面抗原、胞内某种蛋白 免役荧光标记： 与抗体耦联, 直标: 一抗+荧光探针 间标: 二抗+荧光探针 如: 微管蛋白tublin ( 抗 tublin抗体+荧光探针) 肌动蛋白actin
10、 ( Palloidine+荧光探针)2)细胞膜表面受体配体+荧光探针 如: nAchR、mAchR、多巴胺受体(D1,D2) 标记 Gm1: 霍乱毒素受体 霍乱毒素+FITC,激光扫描共焦显微镜应用,2.标记细胞器荧光探针1)线粒体 Mitochondria Rodamin 123 505/534 ，可染活细胞，阳离子, 可检 测线粒体膜电位, 且在多数细胞中停留 时间短 JC1 线粒体膜电位低时为单体 490/527 发绿光 线粒体膜电位高时为多聚体 490/590 发红光 可标记活细胞线粒体，且为检测线粒体膜电位最 佳探针Mitotracker Green FM 490/516, 染活细
11、胞或固定细胞 , 稳定不漏出Mitotracker Orange CMTMRos 551/576, (氧化型)Mitotracker Orange 还原型, 只能染活细胞,激光扫描共焦显微镜应用,2)溶酶体 Lysosome 中性红 541/640: 微偏碱性, 可标记溶酶体等酸性器官 为非特异性 AO : LysoTracker Green DND-26 504/511, 染活细胞 LysoTracker Blue LysoTracker Red3)内质网 Endoplasmic Reticulum DiOC6 484/500: 非特异性, 较高浓度标记内质网, 较低浓度标记线粒体4)高尔基
12、体 Golgi apparatus NBD C6-ceramie 466/536, 可染活或死细胞,激光扫描共焦显微镜应用,细胞器的单克隆抗体5)细胞核 PI propidium iodide 536/617 DNA/RNA 死细胞碘化丙啶EB ethidium bromide 518/617 DNA/RNA 死细胞Hochest 33342 352/461 DNA A-T 活细胞Hochest 33258 352/461 DNA A-T 活细胞DAPI 358/461 DNA A-T 半通透细胞Chromomycin A3 450/470 DNA G-CAO 500/526 DNA 活细胞
13、560/650 RNATOTO-1 514/533 DNA 死细胞SYTO1116 2024 488/ 520 活细胞SYTO1116 2024 521/ 556 活细胞SYTO 17 621/634 活细胞,3. GFP 绿色荧光蛋白GFP的的发现：60年代，Shimomura等首先从水母中分离出一种水母发光蛋白(aequoren)，该蛋白与钙和肠腔素结合后可产生蓝色荧光。然而水母整体几提取的颗粒都呈绿色，后经证实在水母体内还存在另外一种发光蛋白即绿色荧光蛋白 GFP, 后经研究表明，在水母体内Ca2+和肠腔素与水母发光蛋白结合后，水母发光蛋白产生蓝色荧光，GFP在蓝光的激发下，产生绿色荧光
14、 。 将外源基因与GFP DNA 相连, GFP可作为外源基因的报告基因实时监测外源基因的表达.,激光扫描共焦显微镜应用,激光扫描共焦显微镜应用,GFP主要应用: 对活细胞中的蛋白质进行准确定位及动态观察 可实时原位跟踪特定蛋白在细胞生长、分裂、分化过程中或外界刺激因子的作用下的时空表达, 如某种转录因子的核转位、蛋白激酶C的膜转位等。 GFP基因与分泌蛋白基因连接后转染细胞, 可动态观察 该分泌蛋白分泌到细胞外的过程 GFP基因与定位于某一细胞器特殊蛋白基因相连,就能显 示活细胞中细胞核、内质网、高尔基体、线粒体等细胞器的结构及病理过程 可用于观察分子的运动（FRAP）蛋白之间的相互作用（F
15、RET）,激光扫描共焦显微镜应用,三.动态测量Physiology:细胞内离子动态变化测量1).游离Ca2+测量 检测游离Ca2+变化荧光探针的原理：这类探针多为Ca2+螯合剂，不与Ca2+结合时不发荧光，通常也不能进入细胞膜，只有与乙酰甲酯AM相连方可进入细胞内，被细胞内酯酶水解后并与胞内游离钙结合后发出荧光。Kd值为Ca2+解离常数，表明检测Ca2+浓度的范围:0.1xKd-10xkd, Kd和很多因素有关，如pH、 Mg2+、与蛋白的结合、温度等。细胞内生理Ca2+浓度值(10-100n M)，细胞内Ca2+超载浓度值（基础Ca2+浓度的10倍左右）,荧光探针 激发波长发射波长 KdFL
16、uo3-AM, K+, dextran 506nm 525nm 390nMFluo4 506nm 525nmCalcium Green-1 507nm 530nm 190nMCalcium Green-2 507nm 535nm 550nMFura red 420/480nm 637nm 140nMOregon Green 488 494nm520nm 20,000nMCalcium Crimson 583nm 602nm 328nMIndo-1 356nm 405/458nm 230nMFura-2 340/380 476nm 145nM,激光扫描共焦显微镜应用,程序化测量：用timelap
17、se中的编程按钮可进行不同时间序列的扫描测 量。 F/F=(F-Fbase)/(Fbase-FBG)Ca2+浓度绝对测量1）单波长公式法Fluo3: 530nm Kd=450nMCa2+I =Kd(F-Fmin)/(Fmax-F)Fmin: 细胞内无钙时的荧光强度( MnCl2)Fmax：细胞内钙饱和时的荧光强度(A23187)测量时切记细胞内静息Ca2+浓度的相对荧光强度值不能太低（F值不低于40）,激光扫描共焦显微镜应用,细胞内生理Ca2+浓度值（10-8 -10-7 M）细胞内Ca2+超载浓度值（基础Ca2+浓度的10倍左右）2）标准曲线法根据仪器条件和负载条件，以不同Ca2+浓度的Bu
18、ffer(EGTA- Ca2+)做标准曲线，横轴为Ca2+浓度，纵轴为荧光强度3）比例荧光的测量.双波长(比例荧光：ratio) Indo1(360, 420/480), fura2(340/380, 440)Ca2+I =Kd(R-Rmin)/(Rmax-R)Ff2/Fs2,激光扫描共焦显微镜应用,激光扫描共焦显微镜应用,快速Ca2+变化的测量1.改变扫描速度2.采用双向扫描3.减少采样点数(牺牲空间分辨率）4.采用线扫描(xt),细胞器的Ca2+测量1.线粒体内游离Ca2+测量 Fluo-3 + TMRM(线粒体荧光探针，红色）2. 特异定位的重组水母发光蛋白 水母发光蛋白与 Ca2+结合
19、后发蓝光 用含有水母发光蛋白和含有特定细胞器蛋白的表达载体转染细胞，可测定亚细胞器内的游离Ca2+变化 目前已商品化的探针可检测：线粒体、内质网、细胞核内的游离Ca2+，因生物发光很弱不能使用Confocal检测,激光扫描共焦显微镜应用,细胞内游离Ca2+测量的应用钙的特性1细胞内外的电化学梯度103-104倍2细胞膜渗透性稍有改变或钙库释放稍有增加，导致 胞内钙明显升高3细胞内钙为细胞激活“开关”细胞内钙的生理作用1肌肉的兴奋收缩-收缩偶联2神经递质的释放3学习记忆的增强4卵子受精5细胞分裂和再生6细胞调亡7细胞间通讯,激光扫描共焦显微镜应用,8细胞信号传导9. DNA合成10. 基因表达细
20、胞内钙超载与疾病1高血压、脑缺血、心脏病、内分泌病胞内钙浓度异常2糖尿病、风湿性关节炎、多发性硬化病胞内钙浓度增高3人体缺钙骨钙大量丢失，神经细胞的钙浓度增高4老化和老年性痴呆-神经细胞内钙浓度增高 细胞内生理Ca2+浓度值（10-8 -10-7 M）细胞内Ca2+超载浓度值（基础Ca2+浓度的10倍左右）,激光扫描共焦显微镜应用,电刺激引起骨骼肌 细胞的Ca2+振荡,激光扫描共焦显微镜应用,激光扫描共焦显微镜应用,pH值的检测： BCECF-AM 490nm 530nm 6.5-7.5 Snarf-1-AM 488nm 580/640nm 7.0-8.0,自由基的检测荧光探针：H2DCF-D
21、A（504nm/529nm）2-氢，2氯荧光素乙酰乙酸盐 胞外H2DCF-DA 扩散入细胞内 酯酶脱乙酰DCF-H(不荧发光） DCF（发荧光）*样品不能在镜下用汞灯照射及观察 Dihydrorhodamine 123（507nm/529nm）H2rhod123 被动扩散入细胞内 在细胞内被氧化成rod123（发光）,激光扫描共焦显微镜应用,激光扫描共焦显微镜应用,药物进入细胞的动态过程及定位分布 xyzt 扫描,激光扫描共焦显微镜应用,四. 膜电位的测量标记膜电位探针(慢反应）：JC1 510nm 530/590nmDioc5(3) 548nm 573nmDioc6(3) 484nm 500
22、nm快反应探针：Di-4-ANEPPS 496nm 703nmDi-4-ANEPPS 498nm 713nm细胞膜静息膜电位：-70mV线粒体膜电位：-150mV以上均属于阳离子探针，更容易与线粒体亲和，为线粒体膜电位探针,激光扫描共焦显微镜应用,七荧光能量共振转移( fluorescence Resonance Energy Transfer)能量转移：能量从分子的一个部位向另一个部位的传递，或能量从一个分子向另一个分子传递。能量的提供者叫能量供体，能量的接受者叫能量受体。荧光能量共振转移的条件：两个荧光分子：供体-FL1，受体-FL2供体与受体的距离在2-7nm供体的发射波长与受体的激发波
23、长一致,激光扫描共焦显微镜应用,样品要求：1.经荧光探剂标记(单标、双标、三标）2.固定的或活的组织3.固定的或活的贴壁培养细胞应培养在Confocal专用小培养皿或盖玻片上4.悬浮细胞，甩片或滴片后，用盖玻片封片,激光扫描共焦显微镜应用,激光扫描共焦显微镜的发展趋势：连续光谱型Confocal多光子激光扫描显微镜 Multiphoton Laser Scanning Microscopy,双(多)光子激光扫描显微镜的优势,多光子激光扫描显微镜简介,多光子激光器波长从700-1000nm 连续可调 双光子波长：350-500nm 连续 三光子波长：230-330nm 连续 应用：可直接清晰活体观察某些非标记神经递质的分 泌 (5-HT) 或 NADPH的分布,例4 长时间观察活体阿尔茨海默病模型 小鼠淀粉蛋白形成的状况,
