1、实验一 细胞器的光学显微镜观察,实验目的,1、观察人、植物活细胞内线粒体和液泡系的形态、数量与分布2、学习一些细胞器的超活染色技术,实验原理,活体染色：能使生活有机体的细胞或组织特异性着色但对活样品又没有毒害作用的一种活体染色方法，其目的是显示生活细胞内的某些结构，而不影响细胞的生命活动和产生任何物理、化学变化以致引起细胞的死亡。活体染色技术可用来研究生活状态下的细胞形态结构和生理、病理状态。 超活染色：体外活体染色又称超活染色，它是由活的动、植物分离出部分细胞或组织小块，以染料溶液浸染，染料被选择固定在活细胞的某种结构上而显色。活体染料之所以能固定、堆积在细胞内某些特殊的部分，主要是靠染料的
2、“电化学”特性。碱性染料的胶粒表面带阳离子，酸性染料的胶粒表面带有阴离子，而被染的部分本身也是具有阴离子或阳离子，这样，它们彼此之间就发生了吸引作用。但并非任何染料均可用于活体染色，理论上应选择那些对细胞无毒性或毒性极小的染料，且使用时需要配成稀淡的溶液。一般说来，最为适用的是碱性染料，这可能是因为它具有溶解在类脂质(如卵磷脂、胆固醇等)的特性，易于被细胞吸收。詹纳斯绿B(Janus green B)和中性红(neutral red)两种碱性染料是活体染色剂中最重要的染料，对于线粒体和液泡系的染色分别具有专一性。,生物学实验中使用的染色剂分为酸性、碱性和中性，染色剂的酸碱性与化学上用H+的离子
3、浓度来定义溶液的酸碱性不同，染色剂的酸碱性与染色剂的显色基团有关，由主要显色基团是阳离子或是阴离子来确定，若染色剂的主要显色基团是阳离子，为碱性染色剂；若染色剂的主要显色基团为阴离子，为酸性染色剂；若染色剂的显色基团既有阳离子也有阴离子则称为中性染色剂（又称复合染料）。有丝分裂实验用的醋酸洋红和龙胆紫溶液的显色基团均为阳离子，故都是碱性染色剂，亚甲基蓝、美蓝也是碱性染料；酸性品红、伊红是酸性染料，苏丹、苏丹弱酸性染料；对血液进行染色的赖特和吉姆萨是中性染色剂。 在细胞的组成中，原生质的碱性部分（如细胞质）容易与含阴离子的酸性染料发生亲合力而结合；而原生质的酸性部分（如染色质）容易与含阳离子的碱
4、性染料发生亲合力而发生作用。而红细胞具有特殊的性质能与中性染色剂发生亲合力。由此可见细胞成分被染色的强弱与细胞成分的酸碱性以及染料的性质有关。,染色剂溶液的酸碱性 染色剂溶液的酸碱性是指染料溶液的pH值，例如醋酸洋红和龙胆紫溶液均为碱性染料，但它们的溶液却是酸性，而曙红为酸性染料但溶液是碱性，又如中性红是碱性染料而它的溶液呈中性。 染色剂溶液的酸碱性与试剂的成分、反应条件以及染料的溶解度等因素有关。如斐林试剂需要新配制的Cu(OH)2溶液，而双缩脲试剂需要碱性条件的Cu2+与蛋白质的肽键反应形成紫色或紫红色的络合物。又如洋红的等电点是pH4.07-4.5，此时洋红的溶解度最小，只有在高于或低于
5、它的等电点的溶液中才易溶解，醋酸洋红的溶液呈酸性，但它的显色基团的化学性质没有改变，其中的醋酸分子穿透组织的速度快，并能够凝固核蛋白，更有利于对染色体的染色。同样用2%的醋酸配制的1%龙胆紫溶液呈酸性，它对根尖分生区细胞内染色剂的染色效果要好于1%龙胆紫水溶液。 由此可见染色剂的酸碱性不是指染色剂溶液的pH值，而是指染色剂对物质进行染色时与显色有关的主要基团是阳离子还是阴离子,线粒体是细胞内一种重要细胞器，是细胞进行呼吸作用的场所。细胞内氧化磷酸化和形成ATP的主要场所，细胞的各项活动所需要的能量，主要是通过线粒体呼吸作用来提供的。细胞中线粒体的具体数目取决于细胞的代谢水平，代谢活动越旺盛，线
6、粒体越多。线粒体可占到细胞质体积的25%。一般真核细胞中含成百上千个线粒体，植物因有叶绿体的缘故，线粒体数目相对较少，单细胞鞭毛藻仅1个，酵母细胞具有一个大型分支的线粒体，巨大变形中达50万个；许多哺乳动物成熟的红细胞中无线粒体 。线粒体的形状多种多样, 一般呈线状,也有粒状或短线状。线粒体的直径一般在0.51.0 m， 在长度上变化很大, 一般为1.53m，长的可达10m ，人的成纤维细胞的线粒体则更长，可达40m，在胰脏外分泌细胞中可长达1020m，称巨线粒体 。不同组织在不同条件下有时会出现体积异常膨大的线粒体, 称为巨型线粒体(megamitochondria)。分布在细胞功能旺盛的区
7、域。詹纳斯绿 B是线垃体的专一性活体染色剂。线粒体中细胞色素氧化酶使染料保持氧化状态(即有色状态)呈蓝绿色，而在周围的细胞质中染料被还原，成为无色状态。,液泡是细胞内浓缩产物的主要场所，有十分重要的功能。液泡的功能主要是调节细胞渗透压，维持细胞内水分平衡，积累和贮存养料及多种代谢产物。液泡膜具有特殊的选择透性，使液泡具有高渗性质，引起水分向液泡内运动，对调节细胞渗透压、维持膨压有很大关系，并且能使多种物质在液泡内贮存和积累。贮存和积累在液泡中的物质包括糖、蛋白质、磷脂、单宁、有机酸、植物碱、色素和盐类等。具体情况因植物种类、器官组织部位，成熟程度等的不同而异。液泡是植物细胞质中的泡状结构。幼小
8、的植物细胞（分生组织细胞），具有许多小而分散的液泡，在电子显微镜下才能看到。以后随着细胞的生长，液泡也长大，互相并合，最后在细胞中央形成一个大的中央液泡，它可占据细胞体积的90以上。这时，细胞质的其余部分，连同细胞核一起，被挤成为紧贴细胞壁的一个薄层。有些细胞成熟时，也可以同时保留几个较大的液泡，这样，细胞核就被液泡所分割成的细胞质索悬挂于细胞的中央。具有一个大的中央液泡是成熟的植物生活细胞的显著特征，也是植物细胞与动物细胞在结构上的明显区别之一。中性红为弱碱性染料，对液泡的染色有专一性，只将活细胞中的液泡系染成红色，细胞核与细胞质完全不着色，这可能是与液泡中某些蛋白质有关。,线粒体,分生区：
9、分生区一般全长约12毫米，大部分被根冠包围着，是产生新细胞的主要地方。属于分生组织，能使根尖细胞数目不断增加。细胞排列紧密，壁薄、核大、质稠。伸长区：位于生长点和根毛区之间，长度约为几毫米。伸长区细胞逐渐伸长，细胞中液泡开始加大，细胞质和细胞核逐渐被液泡挤到细胞边缘。根的生长主要靠生长点细胞分裂（细胞数目增加）和伸长区细胞的伸长。由于细胞伸长可以达到原来细胞大小的几十倍，因此伸长区的伸长很显著根毛区：根毛区也叫成熟区。因为此区的细胞已停止生长，属于成熟的细胞。在成熟区最外一层的表皮细胞，它的细胞膜、细胞质向外突起逐渐形成根毛。也就是说：根毛是由一个表皮细胞形成的。它的细胞壁极薄，是柔软而胶粘的
10、，有可塑性，易与土粒紧贴在一起，有效地进行吸收作用。成熟区是根吸收水分和无机盐的主要部位。,实验仪器与材料：,1、 器材: 显微镜、恒温水浴锅、解剖盘、剪刀、镊子、双面刀片、解剖盘载玻片、凹面载玻片、盖玻片、表面皿、吸管、牙签、吸水纸 2、 试剂： Ringer溶液（使细胞保持活性）， 1/3000中性红溶液（配好后需装入棕色瓶于暗处保存，否则易氧化沉淀，失去染色能力），1/5000詹纳斯绿B 3 、材料： 人体口腔黏膜上皮细胞、洋葱鳞茎内表皮细胞、小麦根尖,实验步骤：,1、人口腔粘膜上皮细胞线粒体的超活染色与观察清洁载玻片放在37恒温水浴锅的金属板上 滴2滴1/5000詹纳斯绿B染液 用牙签
11、口腔颊粘膜处稍用力刮取上皮细胞（稍微用牙签在峡侧黏膜上涂刮几下就行了，不一定要看到把皮给刮下来的，只要牙签刮了黏膜就会有细胞） 刮下的粘液状物放大载玻片的染液滴中 染色10l5min(注意不可使染液干燥，必要时可再加滴染液) 盖上盖玻片,显微镜下观察,2、植物细胞液泡系的超活染色与观察 取豆芽的根尖 用刀片纵切根尖 放入中性红染液滴中，染色510min。 吸去染液，滴一滴Ringer液 盖上盖玻片进行镜检(镊子轻轻地下压盖玻片，使根尖压扁，利于观察) 实 验 结 果 在高倍镜下，先观察根尖部分的生长点的细胞，可见细胞质中散在很多大小不等的染成玫瑰红色的圆形小泡，这是初生的幼小液泡。然后，由生长
12、点向延长区观察，在一些已分化长大的细胞内，液泡的染色较浅，体积增大，数目变少。在成熟区细胞中，一般只有一个淡红色的巨大液泡，占据细胞的绝大部分，将细胞核挤到细胞一侧贴近细胞壁处。,实验报告,（1）. 绘口腔上皮细胞示线粒体的分布 、洋葱鳞茎表皮细胞中线粒体的分布图（2）.根尖液泡的分布图（3）.何为活体染色和超活体染色,实验二 细胞骨架的显示和观察,实验目的,掌握植物细胞骨架的光镜标本制作方法了解植物细胞的细胞骨架基本形态,实验原理,细胞骨架是指细胞质中纵横交错的纤维网络结构，按组成成分和形态结构的不同可分为微管（MT）、微丝（MF）和中间纤维（IF）。广义的细胞骨架还包括核骨架（nucleo
13、skeleton）、核纤层（nuclear lamina）和细胞外基质（extracellular matrix），形成贯穿于细胞核、细胞质、细胞外的一体化网络结构。它们对细胞形态的维持、细胞的生长、运动、分裂、分化和物质运输等起重要作用。光学显微镜下细胞骨架的形态学观察多用1% （曲拉通100）Triton X-100（聚乙二醇辛基苯基醚）处理细胞，可使细胞膜溶解，使95%以上的可溶性蛋白质以及全部脂质被抽提，而细胞骨架系统的蛋白质被保存， 再用考马斯亮兰R250染色，使得胞质中细胞骨架得以清晰显现。,微丝功能,维持细胞形态，赋予质膜机械强度细胞运动：成纤维细胞爬行与微丝装配和解聚相关微绒毛
14、(microvillus)： 是肠上皮细胞的指状突起，用以增加肠上皮细胞表面积，以利于营养的快速吸收。应力纤维(stress fiber)：在形成粘合斑的质膜下，微丝紧密平行排列成束，形成应力纤维,具有收缩功能。参与胞质分裂：收缩环由大量反向平行排列的微丝组成，其收缩机制是肌动蛋白和肌球蛋白相对滑动。肌肉收缩(muscle contraction),微管的功能,维持细胞形态用秋水仙素处理细胞破坏微管,导致细胞变圆,说明微管对维持细胞的不对称形状是重要的。对于细胞突起部分,如纤毛、鞭毛、轴突的形成和维持, 微管亦起关键作用。细胞内物质的运输细胞器的定位鞭毛(flagella)运动和纤毛(cili
15、a)运动纤毛与鞭毛的结构纤毛运动机制纺锤体与染色体运动,中间纤维的功能,增强细胞抗机械压力的能力 角蛋白纤维参与桥粒的形成和维持 结蛋白纤维是肌肉Z盘的重要结构组分，对于维持肌肉细胞的收缩装置起重要作用参与传递细胞内机械的或分子的信息中间纤维与mRNA的运输有关,实验步骤（第一种方法）,第二种方法,取洋葱的外表皮2 张, 大小约为0 .5 cm0 .5 cm, 放到培养皿中 用0 .01 mol / L 磷酸盐缓冲生理盐水( PBS) 浸泡取得的洋葱外表皮3 次, 每次3min; 再加1% Triton X-100/ M- 缓冲液处理洋葱外表皮约30min; 再用M- 缓冲液浸泡3 次, 每次
16、5 min ; 加甲醇- 冰醋酸混合细胞固定液（甲醇- 冰醋酸混合液31 ）固定细胞, 固定15 30 min; 用0 .01 mol / L 磷酸盐缓冲生理盐水( PBS) 清洗细胞3 次, 每次3 min ; 用镊子将洋葱外表皮细胞取出放到载玻片上, 铺平后用滤纸把水吸干;滴加0 .2% 考马斯亮蓝R250 染液染色30 min; 用水冲洗细胞,等到自然干燥后即可观察。,注:a . 染色15 min ;b . 染色60 min 。Note :a . Staining for 15 min ; b . Staining for 60 min .图1 0.2%考马斯亮蓝R250 染液染色后洋葱
17、表皮细胞(40 16)Fig .1 Onionepidermal cell after staining with0.2% Coomassie brilliant blue R250dyeing solution(40 16)而染色30 和60 min 的照片图像所观察到的效果明显比染色15 min 的好, 但染色60 min 的效果更佳, 图像十分清晰。结果表明, 染色时间一般至少要超过30 min, 染色60 min 的效果比较好。,实验三 细胞形态结构的观察,实验目的,1、掌握光镜下细胞基本形态结构2、初步掌握临时制片的方法3、学习生物绘图的方法4、 认识血涂片中红细胞及各类白细胞的形态
18、构造特点.5、 进一步掌握光学显微镜的使用方法,1、细胞生物学实验绘图方法与要求,一、在仔细观察的基础上，选择典型结构进行描绘，要求真实、准确(注意各部结构的比例关系)。二、用铅笔绘图，线条要明确清晰，图的深浅明暗一律以点的疏密来表示，点要圆而一致，不得涂暗影或进行其它美术加工。 三、各部结构名称要在一侧引直线注明。各引线要平行不得交叉。四、每幅图的大小、位置在纸面上必须安排得当并注意纸面的整洁。,2、各种细胞形态,上皮细胞（人口腔上皮、小肠切片） 单层扁平上皮：人口腔上皮细胞，细胞轮廓呈多边形或不规则的波浪形，每个细胞内有一个圆形核；骨骼肌（横切和纵切） 骨骼肌由骨骼肌纤维构成。骨骼肌纤维是
19、长圆柱状细胞，每一条肌纤维内有大量圆形细胞核（可多达上百个）。其细胞质又称肌浆，含有丰富的肌原纤维、线粒体和脂肪滴等。肌原纤维呈细丝状，沿细胞长轴平行排列。每条肌原纤维都具有明暗相间的带。神经元细胞 神经细胞由两部分组成，即细胞主体和突起。用于感受刺激与传导冲动。 不论细胞的形状如何，细胞的结构一般分为三大部分：细胞膜、细胞质和细胞核。但也有例外。例如：哺乳类红细胞成熟时细胞核消失。,平滑肌细胞,神经细胞,哺乳动物的红细胞呈扁圆形、体积很小，是一种非常特化的细胞。哺乳动物的红细胞无核，亦无其它重要细胞器，主要是由细胞膜包着血红蛋白。这些特点与红细胞交换氧与二氧化碳的功能密切相关。细胞体积小、呈
20、圆形，非常有利于在血管内快速运行，体积小则相对表面积大，有利于提高气体交换效率。细胞内主要是血红蛋白，有助于结合更多的氧与二氧化碳。因此，红细胞的形态和结构装置与其交换气体的功能的关系是非常合理的。精子在细胞后端具有能运动的鞭毛，前端具有有助于进入卵的顶体,红细胞模式图，凹圆盘形，无核,3、实验原理,1、细胞体积虽然差别很大，但大多数都必须借助显微镜观察；2、细胞内含水较多，不染色不易观察，故需用生物染料染色。,4、各种细胞一般形态结构的观察,1、洋葱鳞茎表皮细胞的标本制备与观察（1）标本制作（2）观察：2、人口腔黏膜上皮细胞标本的制备与观察（1）标本制作（2）观察：3、血涂片的制作与血细胞的
21、观察（1）采血与涂片（2）染色（3）观察4、立体细胞的观察（1）标本制作（2）观察,采血前用70酒精棉球消毒人的指腹,采血,由于第一滴血中含单核白细胞较多，因此弃去第一滴血。,推片：挤出第二滴血置于载玻片的右侧,再取另一张边缘光滑的双凹片，斜置于血滴的前缘，先向后稍移动轻轻触及血滴，使血液沿玻片端展开成线状。,3045,两玻片的角度以3045为宜，轻轻将双凹片向前匀速推进，即涂成血液薄膜。,染色,待涂片在空气中完全干燥后，滴加数滴Wrights染液盖满血膜为止，染色13 min。然后滴加等量蒸馏水，使其与染液均匀混合，静置1015 min。用蒸馏水冲去染液，吸水纸吸干，镜检。,结果显示,淋巴细胞,单核细胞,嗜中性粒细胞,嗜酸性粒细胞,嗜碱性粒细胞,
