1、认知侵袭性真菌感染的实验室诊断,汇报人 杨烨建,何为侵袭性真菌感染?,DFI（deep fungal infection）,真菌侵犯毛发、表皮、甲床以外的组织（皮下组织、黏膜、肌肉、内脏器官、中枢神经系统等）引起的感染。,DFI中急、危、重者。真菌在组织器官或血液中生长繁殖，导致炎症反应和组织器官损伤，常伴多器官功能障碍。,IFI（invasive fungal infection）,2007年欧洲癌症治疗研究组织(EORTC)侵袭性真菌感染协作组(IFICG)和美国国立变态反应与传染病研究所霉菌病研究组(NIAID-MSG)将IFI改称IFD。国内未获响应，现仅用于侵袭性念珠菌病(invas
2、ive candidosis,IC)和曲霉病(invasive aspergillosis,IA)。,IFD（invasive fungal disease）,IFI诊断依据,EORTC和NIAID/MSG 2007年修订标准,国内各学会诊治指南。IFI诊断分级： 拟诊（possible） 临床诊断（probable） 确诊（proven）,IFI诊断依据,IFI分级诊断标准,（1）血液真菌培养阳性，但曲霉、青霉（马尔尼菲青霉除外）需排除污染。（2）导管相关性真菌血症，导管培养与血培养均阳性，且为同一真菌。（3）胸水真菌培养阳性。（4）肺组织真菌培养阳性。（5）合格痰标本或BALF镜检发现肺孢
3、子菌包囊、滋养体或囊内小体。（6）胸水、CSF、血液直接镜检发现新生隐球菌。（7）直接导尿培养念珠菌105CFU/ml。,有确诊价值的微生物学检查,常见IFI病原的诊断,以下列念珠菌属最常见: 白色（C.albicans）、光滑（C.glabrata）、 热带（C.tropicalis）、近平滑（C.parapsilosis）、克柔（C.krusei）、都柏林（C.dubliniensis）、季也蒙（C.guilliermondii）。 北京大学人民医院血液科(2004.42005.2间)165株念珠菌，其中： 白念78.8%，其他念珠菌21.2%； 张红金等2006.16月ICU患者并发IF
4、I 137例，其中： 白念65株（47.4%）、光滑36株（26.3%）、热带28株（20.4%）、平滑5株（3.6%）、克柔2株（1.5%）、青霉1株（0.7%）。,常见IFI病原（1）念珠菌属（Candida）,单因素分析: 念珠菌定植、WBC0.5109/L持续10d、使用碳青霉烯类抗生素是恶性血液病患者发生IC的危险因素；多因素分析: WBC0.5109/L持续10d是IC唯一危险因素。,IC发病的重要前提是念珠菌定植,（1）革兰染色、乳酸酚棉蓝染色，镜检46m圆或卵圆芽胞，可见出芽，假菌丝。 用含荧光增白剂（Calcofluor White ，CFW）的10%20% KOH涂片，紫外
5、线激发呈蓝白或绿色荧光。（2） 培养于沙氏培养基生长乳白色酵母样菌落； 玉米粉-Tween80琼脂生长假菌丝、厚壁孢子； CHROMagar培基上（35）菌落呈色：白念-绿色，热带-蓝灰，粉红、边缘模糊-克柔。 其他种为白色至粉红色。血清（鸡蛋清）中37 23h白念产生芽管。 种间鉴别用糖发酵和糖同化试验。,常规检查,（1）测抗原 胞壁1,3-D-葡聚糖（G试验），表面抗原甘露聚糖（LA试验），热不稳定蛋白（LA试验），胞浆蛋白烯醇化酶（ELISA和WB），Mr 65000蛋白（抑制ELISA）等。（2）测抗体 烯醇化酶（P47）抗体（ELISA），白念珠菌芽管抗体（CAGTA）间接免疫荧光法
6、。,血清学试验,（1）以ITSI（internal transcribed spacer 1，内部可转录间隔区1）为靶基因的泛真菌PCR加DNA测序法（可测念珠菌、隐球菌、曲霉、镰刀菌等多种真菌）。（2）泛曲霉念珠菌检测法（pan-AC assay）用种特异探计real-timePCR（常见的6种念珠菌、9种曲霉）。（3）以28SrDNA为靶基因的real-timePCR。可测念珠菌、曲霉、隐球菌、毛霉、青霉等。（4）多串连PCR（multiplex tandem PCR，MT-PCR）以ITS1、ITS2、EF1-、微管蛋白（-tubulin）为靶基因，可测常见念珠菌、隐球菌、曲霉、镰刀菌、
7、接合菌等。（5）反向线点杂交（reverse line blot hybridization，RLB）和基因芯片（oligonucleotide microarray）技术。尚未获批准。,分子生物学诊断,185个种中有20多个可致机会性感染 常见为: 烟曲霉（A.fumigatus）、黄曲霉（A.flavus）、黑曲霉（A.niger）。 棒曲霉（A.clavatus）、灰绿曲霉（A.glaucus）、构巢曲霉（A.nidulans）、米曲霉（A.oryzae）、土曲霉（A.terreus）、焦曲霉（A.ustus）、杂色曲霉（A.versicolor）也有报告。,常见IFI病原（2）曲霉菌属
8、（Aspergillus）,曲霉菌孢子是链状的，成熟后脱落，25m，易在空气中悬浮。经空气吸入孢子致病，与定植无关。,曲霉鉴定主要依靠形态学特征,血清学试验：G试验，GM试验。 分子生物学诊断：同念珠菌属。,包括: 菌落颜色，分生孢子梗形态、颜色，产孢结构数目，顶囊形态等。 烟曲霉耐高温，40（38.550）生长良好。,约78个种，致病的约17个种和8个变种，引起IFI的主要为: - 新生隐球菌（C.neoformans）， - 有新生变种（var.neoformans）（血清型D型）， - 格特变种（var.gatii）（B、C型）， - grubii变种（var.grubii）（A型）。在
9、A、B、C、D、AD血清型中，我国已见A、D及AD型，A型最多。,常见IFI病原（3）隐球菌属（Cryptococcus）,感染途径：经呼吸道吸入孢子（可从鸽粪、按树分离），侵犯肺与神经系统。鉴定要点：沙氏培养基2537均生长。CSF直接或离心沉淀物涂片墨汁染色发现圆或椭圆双层厚壁孢子，外有宽荚膜。菌体可见单个出芽。,血清学试验： 隐球菌荚菌多糖抗原胶乳凝集试验(LA),试剂盒法国PaxtorexTM Crypto Plus,红色胶乳颗粒包被抗糖醛酸木糖甘露聚糖(GXM)单抗。 标本：血清、CSF、BALF、尿，血清和CSF用链霉蛋白酶56、30min预处理。 假阳性：RF500IU/ml时(
10、9/26)；TB患者血清(2/26)。1:4稀释转阴。ELISA法： 多抗包被，酶标记单抗检测。不受RF干扰。分子生物学诊断： 同念珠菌属。,组织病理中的隐球菌（PAS）,墨汁染色中的隐球菌,隐球菌性脑膜炎诊断,脑脊液检查墨汁涂片培养动物接种电镜观察荚膜抗原乳胶凝集试验（LAT）分子生物学的方法涂片和培养对于诊断具有决定意义,直接墨汁涂片,阳性率大约为60%优点：快速简便、可做菌体计数当脑脊液中的菌体数较少 （低于103/mm3 ）常常会有假阴性结果，需要做进一步的检查,真菌培养,对本病的诊断有决定意义，是确诊的金标准诊断的敏感性高于直接真菌涂片脑脊液真菌培养的方法，对于培养的结果具有重要的影
11、响,荚膜抗原乳胶凝集实验（LAT）,LAT是以高效价的抗隐球菌荚膜多糖抗体吸附于标准大小的乳胶上，检测血清或CSF标本中的隐球菌荚膜抗原。特异性接近100%，敏感性约为95%与菌体计数具有平行性，对于预后判断有帮助,属真菌界，子囊菌门，古子囊菌纲，肺孢子菌目，肺孢子菌科，肺孢子菌属。1909年Chagas首先发现（克氏锥虫），至上世纪80年代一直归为原虫（真菌培养基不生长；细胞膜无麦角固醇，对麦角醇合成抑制剂类抗真菌药耐药，但对抗原虫药敏感）。,常见IFI病原（4）卡氏肺孢子菌（Pneumocystis carinii）,直接镜检： 痰（30%）、BALF（75%）、经皮穿刺肺活检（60%）、
12、开胸肺活检（95%）查找包囊等。染色法：Gomoris环六亚甲基四胺银（GMS），亚甲胺蓝、荧光素染色（染包囊壁和囊壁括弧样结构）。培养： Uero、CEI、WI-38、MRC-5和Chang肝细胞等。,血清学试验： 查抗原：荧光素标记单抗测标本中包囊、滋养体，阳性率97%99%。 查抗体：ELISA、IIF、WB查抗体，阳性率50% 90%，假阳性率高。WB法测抗Mr 3500045000抗体，提示活动感染。分子生物学诊断： 同念珠菌属。,无性型在孢子囊内形成不能游动的静孢子，有性型形成接合孢子。毛霉目（Mucorales）、虫霉目（Entomophthorales）中部分种可致毛霉病（mu
13、cormycosis）或接合菌病（zygomycosis）。,常见IFI病原（5）接合菌（Zygomycetes）,毛霉属（Mucor）、根霉属（Rhizopus）、犁头霉属（Absidia）、根毛霉属（Mucor Rhizomucor）、被孢霉属（Mortierella）、共头霉属（Sycephalastrum）、小克银汉霉属（Cunninghamella）、瓶霉属（Saksenaea）等致病的种多。吸入孢子、创伤感染、食入污染食物致病。特点是菌丝侵犯血管，引起栓塞、组织坏死、化脓性反应和肉芽肿。最常播散至脑，鼻窦炎、眶窝织炎、肺炎。鼻脑毛霉病占30%50%，病死率80%90%，次为肺、胃、
14、肠毛霉病。,毛霉目中有7个科、12属、24种致病,直接镜检标本中见90角分支的宽大、透明、无分隔或极少分隔菌丝可诊断。确诊须从组织切片中找到菌丝。虫霉目中1科、2属、3种致病： 蛙粪霉属(Basidiobolus)中的固孢蛙粪霉(B.haptasporus)，耳霉属(Conidiobolus)中的冠状耳霉(C.coronatus)和异孢耳霉(C.incongruus)。传入途径: 微小外伤，昆虫叮咬。,直接镜检标本中宽大、不规则，无分隔的薄壁真菌菌丝及其片段。分子生物学诊断：同念珠菌属。,25菌丝相、37酵母相的致病真菌包括申克孢子丝菌，马尔尼菲青霉、荚膜组织胞浆菌、粗球孢子菌、巴西副球孢子菌
15、、皮炎芽生菌等。有的有地域分布特点；对人致病力强，感染无须免疫受损。,常见IFI病原（6）双相型真菌,申克氏孢子丝菌镜下特征,纤细分支分隔菌丝直角分枝的分生孢子梗，顶端梨形或圆形小分生孢子，呈“梅花瓣样”结构有的小分生孢子沿菌丝两侧排列，呈“袖套状” 酵母相镜下可见革兰阳性卵圆形或梭形孢子,自然界土壤、竹笋、甘蔗中（25）多以菌丝形式存在，组织中形成酵母样细胞，两端钝圆，有横隔。竹鼠为带菌动物。吸入本菌孢子或食入霉变甘蔗发病。侵犯单核吞噬细胞系统，全身重要脏器均可受累。所致IFI 70%见于AIDS患者。,马尔尼菲青霉（Penicillium marneffei）,骨髓、外周血涂片，皮肤、淋巴
16、结活检组织涂（切）片，溃疡分泌物涂片，巨噬细胞内外直径23m，有13个横隔的椭圆（腊肠）形细胞。糖原染色可与黑热病LD小体和荚膜组织胞浆菌鉴别。培养阳性为诊断金标准。阳性率骨髓100%，皮损90%，血液76%。血清学试验检测Mp1基因编码的本菌特异的胞壁甘露糖蛋白Mp1P抗原或其特异抗体。分子生物学诊断：同念珠菌飞行属。,马尔尼菲青霉鉴定依据,双相菌直接或病理检查找到腊肠形孢子 菌落特征（培养基被染成红色）和镜下结构（帚状枝及孢间连体）在察氏培养基上生长不良（麦芽汁培养基上生长良好）,菌丝相,酵母相,菌丝相(正面),菌丝相(反面),马尔尼菲青霉,腊肠形孢子,某些种与大骨节病、克山病、食管癌有关
17、，在真菌性角膜炎中占58.7%。可致心、脑、肺感染和真菌血症。引起的IFI逐年增多，发病率、死亡率仅次于白念珠菌和曲霉所致感染。吸入本菌致肺感染，类似IA。侵犯血管引起血栓致组织坏死。,常见IFI病原（7）镰刀菌属（Fusarium）,特征：典型镰刀形大分生孢子，大、小不等，有25个分隔。但即使多次分离出同一真菌也只能是疑诊。确诊：培养阳性，病理组织切片发现本菌。,介绍两个实验,GM试验 G试验,GM试验 检测曲霉半乳甘露聚糖（galactomannan,GM）抗原。 试剂盒：Bio-Rad公司 PLATELIATM Aspergillus EIA. 原理： 一步酶免疫夹心微孔板法,（1）GM
18、连续2次阳性 有临床诊断价值。（2）GM阴性不能排除IA（GM低于可测限）；高危患者应每周2次筛查。（3）A值0.000提示操作、试剂、仪器有误，应复测。（4）假阴性：见于慢性肉芽肿病，Jobs综合征及某些用抗真菌药治疗的IA患者。,结果解释：,（5）假阳性： 青霉属（Penicillium）、交链孢属（Alternaria）、拟青霉属（Percilomyces）、地丝菌属（Geotrichum），组织胞浆菌属（Histoplasma）真菌与EBA-2单抗有交叉反应。 某些谷类制品、乳脂点心中含半乳呋喃糖（galactofuranose），牛奶制品（humanized milks）含高浓度GM
19、，常在婴儿造成GM假阳性。 某些批次半合成内酰胺抗生素（piperacillin/tazobactam，amoxicillin与clavulanic acid）中含GM抗原。（6）GM试验对中性粒细胞减少症IA患者诊断价值较高，对非中性粒细胞减少的IA诊断价值较差。,G试验： 检测真菌(念珠菌、曲霉、肺孢子菌等)壁1,3-D葡聚糖(glucan). 适用于念珠菌、曲霉、肺孢子菌、镰孢霉等引起的感染。 试剂盒: Glucatell (美国Cape Code公司), 2003年美国FDA批准, 美洲鲎: 界值60pg/ml。 Fungitec.G(日本Seikagaku Kogyo公司),东方鲎:
20、 界值20pg/ml。 Goldstream(北京金山川公司): 界值20pg/ml。,试验原理 类似检测细菌内毒素的鲎试验(limulus lysate test),细菌内毒素/1,3-D-glucan激活鲎变形细胞裂解物中的凝固酶原，生成凝固蛋白，引起浊度/色度变化。根据标准曲线得出检样中1,3-D-glucan含量。,参考值 20pg/ml IFI（不能区分真菌种属） 以50pg/ml为阳性, 诊断IFI敏感性63.6%, 特异性90.8%. Cut off值, 敏感性, 特异性尚待大规模临床验证。,1、真菌感染检查知识普及，人才培训。2、质优价廉的商品试剂盒供应。3、产、学、研结合，研发验证新方法、新试剂。,几点建议,IC和IA的相关血清学研究,分离提取白念珠菌烯醇化酶基因工程制备白念珠菌烯醇化酶动物模型考察侵袭性白念珠菌感染后抗体产生规律制备烯醇化酶单克隆和多克隆抗体蛋白质组学技术筛选烟曲霉优势抗原巢式PCR技术检测烟曲霉DNA用烟曲霉分泌蛋白检测侵袭性曲霉病人以及疾病模型动物抗体，评估诊断价值。,展望,血清学方法有益于IC的早期诊断；目前市场提供诊断试剂品种少，检测的敏感性、特异性尚不能满足需要；解决IC早期快速诊断问题任重而道远，需要同仁们共同努力！,谢 谢！,
