1、新型围相苯取毛细管电泳在线联删系统的设计与评价Design and evaluation of a new online coupling system of solid phaseextraction and capillary electrophoresisAbstractIn recent years，capillary electrophoresis(CE)has shown a tremendous growth in manyfields because of its excellent separation efficiency，short analysis time，minim
2、al need ofsamples and high versatility in terms of separation modesThe most commonly used detectionmethod in CE is UV spectrometryHowever，the poor concentration sensitivity，restricting itsapplication in the analysis of biological samples containing the analytes in low concentrationsThe integration o
3、f solid phase extraction(SPE)with CE call overcome the aforementionedlimitation effectivelyIn this paperan online coupling system of SPE with CE(SPECEUV)is presented，which uses a homedesigned sheath flow gating interface(SFGI)This system allows forautomatic and precise transfer an exact fraction of
4、eluent from SPE tO CE under the control ofa programmed computerimplying that it is convenient for the present SPECEUV systemto perform the“zonecutting“operationAfter the operating conditions for SPE，CE and SFGl were optimized independently，theSPECEUV system was evaluated using a poly methacrylic aci
5、dethylene dimethacrylate(MAA-EDMA)silicamicrospheresencapsulated monolithic column(15 cm long，250 gmid)as SPE column，and clenbuterol(CLB)as the test analyteA complete run composing ofsample loading，elution，accumulationinjection，washout and separation steps can be finishedin 20 minThe enrichment fact
6、ors of the independent SPE and the system are 575 and 563，respectivelyThe plate numbers are 1 5376 and 23033 for the independent CE and thecoupling system，respectivelyThe above experimental results indicate that the system doesnot degrade the SPE enrichment factor and CE separation efficiencyThe det
7、ection limit forCLB is 28 ggL(SN=3)Finallythe present SPECEUV system was applied to the determination of CLB inurineThe recoveries of the samples spiked at three levels are in the range of 92641 0632，and the precision is 46(RSD，n=7)，demonstrating that the system is reliable in the realsample analysi
8、sKey Words：Solid phase extraction；Capillary electrophoresis；Online couplingII辽宁师范大学硕士学位论文目 录摘 要IAbstractIIl引。言111固相萃取技术1111固相萃取的基本原理及优点2112固相萃取的步骤一3113固相萃取的发展方向一412毛细管电泳技术5121毛细管电泳的基本原理与分类一5122毛细管电泳的特点与应用一513固相萃取与毛细管电泳联用6131四种联用模式一6132 SPECE在线联用系统714本论文的工作102固相萃取毛细管电泳在线联用系统的搭建1121引言l 122实验部分11221仪器与
9、试剂11222整体柱的制备12223固相萃取毛细管电泳在线联用系统的搭建12224联用系统操作的时间流程1323结果与讨论1424小结l 53固相萃取一毛细管电泳在线联用系统的评价1631实验部分16311仪器与试剂16312溶液的配制16313实验条件1632结果与讨论17321固相萃取操作条件的优化17322毛细管电泳操作条件的优化20新型同相萃取毛细管电泳在线联用系统的设计与评价323接口操作条件的优化21324系统的评价2333小结254应用联用系统对尿液中的盐酸克伦特罗进行分析2641实验部分26411仪器与试剂26412溶液的配置26413实验条件2642结果与讨论26421尿样分
10、离26422加标回收率27423重现性考察2843小结28结论与展望29参考文献30附录常用缩写英汉对照39攻读硕士学位期问发表学术论文情况一40致 谢41辽宁师范大学硕十学位论文1引言近年来，毛细管电泳技术(Capillary Electrophoresis，CE)越来越受到研究者的青睐，其作为一种分离分析方法已被应用到各领域中，尤其在DNA和RNA分析【l。J、药物分析【4，5】、蛋白质组分离(多维)【6，7】、无机离子【8，91等领域进展迅速。同传统的高效液相色谱和气象色谱相比，毛细管电泳具有十分显著的优势：分离柱效高，分析时间短，样品用量少，分离模式多元化等【l。通常该方法是利用光学原
11、理进行柱上检测的。由于受到进样体积(1100 nL)和毛细管内径(25100m)的制约，毛细管电泳光检测分析法的浓度灵敏度较低，致使该方法的应用受到了一定的限制【ll，12J。而生物样品通常都是痕量级的，因此，提高毛细管电泳检测灵敏度势在必行。可以通过以下方法来提高CE检测灵敏度：1使用灵敏度更高的检测技术，如激光诱导荧光法(Laser-InducedFluorescence，LIF)，质谱分析法(Mass Spectrometry，MS)和安培法Il 3。7】等；2改进检测池的构形，以增加光程，如使用z形、u形检测池【l 8。20】等；3电泳分析之前对样品进行预富集。现阶段，已提出了许多基于
12、电泳【21。231和色谱【24。291原理的预富集技术，这些方法通过提高目标分析物的浓度，进而有效地提高了电泳光检测分析的灵敏度。电泳预富集是根据分析物在不同区域中电泳淌度的不同而进行的，包括等速电泳(Isotachophoresis，iTp30,311)、场放大进样(Field Amplification Injection，FAIl321)、样品堆积(stackingl33】)和扫集(sweeping34J)等。这些方法虽然操作简单，但其进样的体积会受到毛细管内内径细的制约。此外，分析复杂样品时，样品中其他组分可能会和目标分析物同时富集，从而影响分离效果。色谱预富集方法是将大体积低浓度的目
13、标分析物吸附在固定相上，然后用小体积的洗脱液将其沈脱下来，达到萃取富集的效果。这种方法不仅降低了检测刚巧。37】，提高了灵敏度，同时还有效地避免了样品基体的干扰。目前，最常用的色谱预富集方法主要包括固相萃取(Solid Phase Extraction，SPEpl】)、固相微萃取(Solid Phase Microextraction，SPMEl4HoJ)等。固相萃取与毛细管电泳的联用(SPECE)能够有效地解决电泳光检测灵敏度低的问题，现已有许多文献对该方法进行了报道，并获得了一定程度的成功。11固相萃取技术固相萃取是在传统的液一固萃取和液相色谱的基础上衍生而来的一种样品预处理方法，现已广泛
14、应用于环境4750】、生化51掰】、食品155,561等领域。固相萃取柱作为商品柱的首次问世于1978年，至今已有近40年历史了。目前，应用最多的主要有硅胶类【5、键合硅胶类【58】、氧化铝类【59】和硅镁类固相萃取柱【删等。同其他传统的样品预处理方法相新型同相摹取一毛细管电泳在线联用系统的设计与评价比，固相萃取技术以其有机溶剂消耗少，富集倍率高，环境污染小，不易乳化等特点被人们所青睐。此外，固相萃取的选择性比较高，可针对性的依据待测组分的特点而选用柱材料，增加对分析物质的富集能力，并有效地对实际样品中干扰组分进行纯化达到预分离的目的。同样，也可以要求待测组份不保留，而使干扰组分停留于萃取柱罩
15、，以分离干扰杂质。111固相萃取的基本原理及优点固相萃取是依靠柱内固相填料上键合的官能团与目标物质之间的相互作用力，对目标分析物与样品基液进行分离，以期达到样品纯化富集的效果。它是一类包含液、固两相的物理变化。整个过程中，柱内固定相对目标分析物的吸附能力高于样品基液，当溶液流经萃取柱时，目标物质被吸附于固定相表面，而其他的组分随着样品基液流出柱子。然后，选用合适的解析液进行洗脱，此过程中，固定相与解析液之间的相互作用力强于与被吸附物质之问的相互作用力，因此富集在固柱内的物质能够被洗脱下来。虽然固相萃取与高效液相色谱(High Performance Liquid Chromatography，
16、HPLC)的基本工作原理大致相同，但目的却大相径庭：HPLC旨在最短时间里，维持较好的峰形的前提下将混合溶液中各组分分丌，目的在于分离；而SPE是要将混合基液中的目标分析物萃取在固相萃取柱上，同时不保留干扰杂质，方便进一步的分析，其目的在于富集。由此，为了增加固相填料的表面积，就填料颗粒而言，SPE柱往往要比HPLC柱的要大上许多，且颗粒不规则。富集倍率是综合评价固相萃取效果的重要参数，定义为洗脱液中样品浓度与样品上样浓度的比值，其公式如下：C洗脱液富集倍率=C上样其中，C洗脱液，C卅分别代表，洗脱液中样品浓度和上样时样品溶液浓度。此外，顾等人提出了一种新的富集倍率计算方法【6，这个方法较之于
17、上面的公式更加准确，更具有说服力。实验配置高浓度和低浓度的两份目标分析物系列标准溶液，高浓度的系列溶液分别进行检测，制作吸收峰高对浓度标准曲线，曲线斜率为a；对低浓度的系列标准溶液进行富集后检测，制作吸收峰高对浓度标准曲线，曲线斜率为b，则两条标准曲线的斜率之比(ba)即为富集倍率。影响富集倍率的因素有很多，且这些影响因素相互依存相互制约如图11所示。富集倍率主要受到上样体积和洗脱体积的影响，理想的富集效果即是大体积上样，小体积洗脱，能够有效地将大量的样品萃取于较小体积的洗脱液之中，达到浓缩的目的。辽刊币范人学硕+学位论文图11影响富集倍率的相关参数之间关系SPE技术具有许多优点，总结如下：
18、(1)不易乳化，分离速度快，对环境造成的污染小，符合当今绿色化学的要求。 (2)富集倍率高。固相萃取要求大体积上样，小体积洗脱。通常上样体积为几百毫升，而沈脱体积仅为几毫升，其富集倍率达到数百至数千倍。 (3)有机溶剂消耗少。目标分析组分经SPE柱富集后，仅需少量的解析液就能将其洗脱下去。(4)纯化样品预分离。不同于其他的预处理方法，SPE能够有选择性的吸附目标物质，而干扰组分不被富集，而达到纯化样品，干扰组分预分离的目的。(5)便于运输及储存。液体样品的储存运输过程中易发生损失变化和危险，大体积的液体样品更麻烦，SPE可以将目标分析物富集于整体柱上储存，方便存储运输。此外，固相萃取还具有操作
19、简便，自动化程度高，可批量处理样品等特点。112固相萃取的步骤固相萃取过程主要由整体柱预处理，上样，冲洗和洗脱分析四个步骤组成。(1)预处理：在固相萃取实验之前，要对整体柱进行预先处理，以保证柱子处于最佳条件，不影响富集效果。整体柱的预处理目的有二：一是除去滞留在固定相中的杂质；二是使填料溶剂化，提高其富集能力，保持良好的稳定性。首先对柱子通甲醇溶液(15 min)，使之充分活化，然后通缓冲溶液(15 min)将滞留于其中的甲醇溶液冲出。如若整体柱未经预处理或者未被溶液润湿，会造成目标分析物提前穿透，降低回收率，降低富集倍率。(2)上样：整体柱经预处理后，样品基液经气体泵或色谱泵加压流入SPE
20、柱，目标分析物被吸附在固定相表面，称为上样。为确保目标分析物的充分吸附，样品基液中有机溶剂含量不宜过高。当以缓冲溶液作为溶剂，反相机理进行新型I司相萃取毛细管电泳在线联用系统的设计与评价吸附时，样品基液中有机溶剂量应小于10(vV)。此外，为预防样品的流失，可用弱溶剂来稀释样品溶液，减小溶液体积，提高萃取柱中的填料量，选择强保留能力的吸附剂等方法。萃取柱的尺寸和类型直接决定了能够被吸附的样品量，在样品溶液中，目标组分的保留能力与基液中目标分析物的浓度等因素有关。固相萃取实验中，对于整体萃取柱，目标分析物穿透之前，能够上样的最大体积即为穿透体积(也称突破体积)穿透体积的实验对于固相萃取很重要，基
21、液中样品浓度一致时，穿透体积越大，说明柱子对该分析物的富集效果越好。(3)冲洗：在上样后应加一步冲洗，将萃取柱内滞留的干扰杂质冲出，保证目标分析物的纯净性。冲洗时应使用中等强度的溶剂，在确保目标物质仍保留在柱内的同时，能够将干扰组分洗脱下来。为尽可能多的洗掉被吸的干扰物资，需要优化冲洗溶剂的强度与体积。首先对萃取柱进行上样，然后使用体积为510倍SPE柱体积的溶液冲洗，收集流出液依次进行分析，不断增加冲洗溶液的强度，通过所获得的目标分析物的峰的轮廓，确定冲洗溶液的最佳强度及体积。(4)沈脱与收集：当完成上述步骤之后，就要将被吸附的物质完全洗脱下来。这一过程中，洗脱液的强度非常重要：强度高的洗脱
22、液洗脱时所需体积小，富集倍率高，但同时也会将除分析物外的强保留杂质被洗脱下来；反之，强度低的沈脱液洗脱时所需体积较大，富集倍率低，但不易将干扰杂质洗脱下来。另外，还可以利用N2吹干收集到的流出液，再溶解于小体积的液体中，为进一步的分析提高浓度及调整溶液性质。为了确定最佳的洗脱液强度和体积，对萃取柱进行依次洗脱，测定色谱峰高并计算回收率。此外，洗脱液的pH值、浓度、速度以及有机溶剂的含量都会对洗脱效果造成影响，因此都应通过实验一一优化。113固相萃取的发展方向目前，人们对于固相萃取的研究焦点主要集中在，开发新型吸附剂、创新萃取形式、实现操作自动化等方面。随着研究的深入，人们对固相萃取提出了新的期
23、望，如拓宽富集极性，提高富集选择性等，传统的反相十八烷基键合硅胶型吸附剂，已不能满足上述要求。一种新型的分子识别(Molecule Recognition)型吸附剂备受瞩目，多篇国内外论文对此进行了综合阐趔62柳J。固相萃取可实现高自动化，上样、冲洗、洗脱等过程均可由自动阀进行控制，这样样品在萃取时无需进一步转移，由此很大程度的降低了其受污辽j。师范人学硕士学位论文染的可能性，提高回收率。目前市场上，自动SPE装置的自动化程度都很高，许多仪器开发商都致力于该装置的生产与完善。另外，SPE还可以与其他分析技术相联用(如高效液相色谱、气相色谱、质谱和毛细管电泳等)。随着联用技术的发展，一种分析速度
24、更快，自动化程度更高，稳定性更强的痕量物质分析法68,69】随之建立起来。12毛细管电泳技术121毛细管电泳的基本原理与分类广义上，电泳也是色谱分离技术的一种，定义为带电粒子在电场中的定向移动，其分离原理是带电粒子在介质中电迁移速率的差异【7。毛细管电泳技术就是以高电压(通常可达30 kV)为驱动力，以电渗流为推动力，以石英毛细管为分离柱，依据各组分问不同分配的差异来实现分离的一类液相色谱技术。在电场力的作用下，缓冲溶液体系中，所分析的物质的电迁移速率不同，在毛细管柱中移动的速度不同，从而达到分离各组分的目的。除了目标分析物本身的作用及缓冲液体系的特性外，也存在其他影响分离的因素，如分离电压、
25、柱温、柱长等。根据分离机理的不同，毛细管电泳可分为多种分离模式，常见的有毛细毛细管凝胶电泳(Capillary Gel Electrophoresis，CGE)；毛细管区带电泳(Capillary ZoneElectrophoresis，CZE)；毛细管等电聚焦色谱(Capillary Isoelectric Focusing，CIEF)：毛细管等速电泳(Capillary Isotachophoresis，CITP)；微团电动毛细管电色谱(MiccellarElectrokinetic Chromatography，MEKC)及毛细管电色谱(Capillary Electrochromato
26、graphy，CEC)等【7。其中，最常用、最简单、最基本的是CZE技术，可将其视为其他各种分离模式的母体。122毛细管电泳的特点与应用与传统的分离方法相比，毛细管电泳具有许多特点，总结如下： (1)内径细。检测池为内径很细的(2575岬)的石英毛细管； (2)缓冲液电阻高。通常电泳分离电压很高(1030 kV)，电场强度也很高(1001000 Vcm)，缓冲液的高电阻可以阻止电泳产生焦耳热效应； (3)分离效率高(N105)，一般电泳分析可在数秒至数十分钟内完成； (4)进样体积小，试剂用量少。为了保证好的分离效率高柱效，通常进样都是纳升级别的(150 nL)； (5)分离模式多元化，应用领
27、域广； (6)绿色环保。电泳分离一般都在水溶液中进行，对环境污染小； (7)操作简便，易实现自动化。新型刮相萃取一毛细管电泳在线联用系统的设计与评价毛细管电泳技术的应用领域广泛。可用于代谢产物及生物小分子的分析；天然产物、中药成分的分析；核酸、基因的分析；阴、阳离子的检测；临床标志物的诊断检测以及氨基酸、多肽、蛋白质手性拆分等。13固相萃取与毛细管电泳联用将固相萃取与毛细管电泳进行联用不仅可以有效地提高检测灵敏度，降低检测下限，还可以纯化实际样品，便于自动控制。131四种联用模式固相萃取与毛细管电泳的联用包括离线式【72-751(off-line)、自动离线式【7679】(at-line)、内
28、嵌式【80培51(in-line)和在线式f86别(on-line)四种模式。四种联用模式的连接示意图见图12。SaunrlplePreparationCE Module。?7薯囊囊参萋霪il鬻l鬻鬻， jI i，。0藏；曩，善。鬻灏r 擘j。?5蠢蕊“、鬻鬻鬻黼譬 t。：i ii蠹i羹篝鬻；誊鬻钮多 一、|j 1；1 i：-；il：；攀纛蒸、 j j鬣瑟缀鬻lj-叠。 誉雾i*夔戮；图12固相萃取与毛细管电泳的四种联用模式离线式联用，在固相萃取和毛细管电泳之间没有直接的连接，萃取柱流出液由人工手动收集并转移至毛细管电泳系统，二者互相独立的完成各自的工作；自动离线式即离一6一辽宁师范人学硕士学
29、位论文线式的自动化，也就是在固相萃取和毛细管电泳之间安装一个自动转移装置来替代人，但同样两系统之间没有直接的液流连接；内嵌式是将固相萃取材料内嵌入毛细管电泳柱前端，这根毛细管既是固相萃取柱也是毛细管电泳柱，这是一种完全意义上的连接；在线式联用，是在固相萃取和毛细管电泳之间架置一个特殊设计的接口，这个接口将二者进行物理连接，萃取柱的流出液流经接口并进入到毛细管电泳中，这种联用方式，将两个相对独立的系统有机结合在一起，却没有完全连在一起。与离线式、自动离线式联用相比，内嵌式和在线式具有分析时问短、手动操作少、样品损失风险小和自动化程度高等优点。然而，在内嵌式SPE-CE系统中，由于SPE柱直接嵌入
30、在CE毛细管的前端，SPE吸附剂的阻力会影响电泳的上样速度，同时吸附剂的存在也影响着电泳的分离。除此而外，由于在上样时，样品溶液流经整个CE系统，潜在的污染也会对电泳分离造成诸多不良影响38391。与内嵌式联用不同，在在线式系统中，SPE柱与CE毛细管通过一个特殊设计的接口实现物理连接，这使得SPE与CE可以相对独立的操作与优化，在很大程度上解决了内嵌式SPE-CE中存在的问题阳J。因此，在线式SPECE更值得关注与研究。132 SPE-CE在线联用系统迄今为止，已经报道了多种SPE-CE在线联用装置，包括valve-loopt91-931(图13)，T-split8894，95】(图14)，valve-loo州ial【89,96-101】(图15)，two_leveled two cross【102,1031，(图16)，以及flow-gatingtl041叫(图17)型在线联用系统。wr?鼯 VIr1C图13 valveloop型联用系统【931 图14 T-spl it型联用系统951
