1、PAGE 胶及银染详细步骤转载生物信息学 2010-12-02 20:03:10 阅读 234 评论 0 字号：大中小 订阅 PAGE 胶及银染详细步骤变性聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质的电泳方法。在这种支持介质上可根据被分离物质分子大小和分子电荷多少来分离。聚丙烯酰胺凝胶电泳适宜分离鉴定低分子量蛋白质、小于 1Kb的 DNA 片段和 DNA 序列分析，其装载的样品量大，回收 DNA 纯度高，长度仅相差 0.1%(即 1000bp 中的 1bp)的核苷酸分子即能分离。聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺单体，在催化剂 TEMED(N，N，N ，N 一四甲基乙二胺)和过
2、硫酸铵的作用下，丙烯酰胺聚合形成长链，聚丙烯酰胺链在交联剂，N，N 一亚甲双丙烯酰胺（交联剂）参与下，聚丙烯胺链与链之间交叉联接而形成凝胶。聚丙烯酰胺凝胶孔径的大小是由丙烯酰胺和交联剂的浓度及比例决定的，不同浓度丙烯酰胺和 DNA 的有效分离范围见下表.丙烯酰胺(%) 有效分离范围(bp) 溴酚兰* 二甲苯青*3.5 1002000 100 4605.0 80500 65 2608.0 60400 45 16012.0 40200 30 7015.0 25150 15 6020.0 10100 12 45*表中给出的数字为与指示剂迁移率相等的双链 DNA 分子所含碱基对数目(bp)。一 器材及
3、试剂1.电泳仪，垂直电泳槽及其附件，玻璃板，常用实验器材等。2.玻璃板处理试剂：（1） KOH/甲醇溶液：5gKOH 溶于 100ml 甲醇中，用于清洗玻璃板。（2 ） 95%乙醇（3） 亲和硅烷溶液：95%乙醇 4ml冰乙酸 20ul亲和硅烷 20ul（4） 玻璃硅烷：用移液器取适量于短板上，用无尘擦拭纸涂抹均匀。2.丙烯酰胺溶液 45%丙烯酰胺：43.4 克N，N一亚甲基双丙烯酰胺：1.6 克H2O，加至 100ml装于棕色瓶内，4 可保存二个月。3.变性剂尿素 0.7g/ml：称取 175g 溶于 125ml 左右水中，定容到 250ml。4.过硫酸铵 0.1g/ml：称取过硫酰铵 1g
4、 加水至 10ml。4可保存一周，-20可保存一个月。5.TEMED(四甲基乙烯基二胺)：和过硫酸铵一起作为交联反应的催化剂。易吸潮，4封闭保存。6.1XTBE 电泳缓冲液TBE 电泳母液（5）的配制1）分别称取 54 克 Tris 碱，27.5 克硼酸，20ml 0.5mol/EDTA（PH=8.0）2）将各组分别加入 1 升烧杯中，用 ddH2O 定容到 1 升。3）在电泳时使用 1 倍工作液，按 1：4 与水混合。4）1 倍液是为了增加电泳工作液的电流的电流量。5）盛于玻璃瓶，在室温保存。使用同样的 TBE 配制胶和电泳液，因为两者间微小的差异就会导致 DNA 扭曲。7.上样缓冲液:含有
5、变性剂8.超纯水及灭菌的超纯水二 聚丙烯酰胺凝胶的制备根据分离 DNA 片段的大小及需凝胶的容积，配制聚丙烯酰胺凝胶.1.玻璃板处理：KOH/甲醇溶液或 KOH 溶液浸泡玻璃板一定时间，用去污剂和清水清洗干净，最后用双蒸水冲洗两遍。自然晾干。用 95%乙醇擦拭长短板。长短板分别用亲和硅烷和玻璃硅烷均匀擦拭。5-10 分钟后再用 95%乙醇擦拭长短板。2.固定玻璃板：处理面向上，把两个封条分别置于两侧，把梳子置于长板一端的两封条间。短板处理面向下盖到长板上，用夹子固定，再用胶带封闭除放有梳子一端外的其它三边缝，防止漏胶。把固定好的玻璃板长向倾斜适当角度（300），短向倾斜角度（200-300）3
6、.配制胶溶液（5%）： 原胶： 8.34ml尿素： 45ml5xTBE： 15ml双蒸水：6.66mlTEMED: 30-36ulASP： 240ul注：由于尿素在室温难溶解，故在配制胶时应提前把尿素溶液置于 55水浴中预热，是尿素完全溶解。4.灌胶：把梳子取出，用注射器取大约 50ml 的胶溶液，缓缓地使胶溶液注入两板间，等胶溶液快要溢出时，把玻璃板放平，倒插梳子，用夹子夹紧使梳子和玻璃博间没有缝隙从而防止点样时串样，整个过程不要产生气泡。5.凝固：灌完胶后，放于室温让其自然凝固，观察胶边沿出现折射线就表明胶以凝固。凝胶可立即使用，或保存于室温 24 小时，4 48 小时。三 聚丙烯酰胺凝胶
7、电泳1.固定玻璃板于电泳仪：取掉玻璃板上的夹子，撕掉胶带，用清水冲洗干净玻璃板，短板向里固定于电泳仪支架上，即凹口板面向电泳液。2.预电泳：取 5xTBE200ml 稀释到 1000ml 制成 1xTBE。向电泳仪下端槽内倒 1xTBE 约 500ml，向上槽倒 1xTBE，使液面高于短板上沿。拔出梳子，并用注射器吸取适量电泳液把点样孔洗干净（因为梳子取出后，梳子上吸附的及凝胶顶部未聚合的丙烯酰胺会流入加样孔内聚合，产生不规则的表面，将导致以后 DNA 电泳带型不规则）。打开变压器，调节电压为 80W，预电泳 30min。3.电泳:1）上样：插入梳子，在预电泳期间把选择性扩增产物 94变性 1
8、0min 后，迅速置于冰上冷却。向选择性扩增产物中按 2：1 的比例加上样缓冲液并混匀，取 5-6ul 上样。2）调节电压 60W，电泳 2 小时左右。根据指示剂迁移位置来判定是否终止电泳。电泳完毕，关掉电泳仪。取下玻璃板，用冰袋冷却，准备显色。聚丙烯酰胺凝胶电泳只能检出10ng 以上量的 DNA 条带.要求更高的灵敏度，可用银染。四 聚丙烯酰胺凝胶电泳的显色- 银染银染的原理：银离子和 DNA 结合，还原剂甲醛把银离子还原成银颗粒，使 DNA 条带呈黑褐色而显现出来。其灵敏度比 EB 高 200 倍，但银染色后，DNA 不宜回收。1.固定：固定液 冰醋酸： 150ml（10% ）双蒸水：13
9、50ml把经冷却的胶板置于盛有 1.5L 的塑料盘中，摇床震荡 30min 左右。2.洗胶：把经固定的胶板置于盛有 1.5L 双蒸水的塑料盘中清洗两次，每次 2-4min。3.染色： 染色液 硝酸银： 1.5g（0.1%）37%甲醇：2.25ml加双蒸水至 1.5L把清洗干净的胶板置于盛有染色液的塑料盘中，摇床震荡 30min 左右。4.洗胶：把经固定的胶板置于盛有 1.5L 双蒸水的塑料盘中清洗一次，该步骤动作要迅速，约 3s。5.显色：显色液 碳酸钠： 45g(0.03g/ml)37%甲醛： 2.25ml（0.15%）硫代硫酸钠：300ul(10mg/ml)加双蒸水至 1.5L把清洗干净的胶板置于盛有显色液的塑料盘中显色。显色时间根据条带和背景颜色深浅调整，达到DNA 条带清晰的目的。显色液一定要预冷至 4-10，否则会使被背景加深。6.终止显色：把染色完毕的胶板放回盛有固定液的塑料盘中，反应 3min。用双蒸水清洗两次（每次2min）。7.干胶：胶板置于室温自然干燥。8.条带统计。注：1.固定时间可以减少，只要指示剂颜色消失即可2.提高硝酸银浓度（0.2%），可减少染色时间。http:/
