1、实验二 病料的采集、保存及送检一、目的 掌握被检病料的采取、保存、送检的方法。二、材料 实验动物（鸡）、瓷盘、剪子、镊子、酒精灯、酒精、接种环、载玻片、火柴棒等。三、病料的采取1.采取病料的基本原则(1)采集最适病料 理想的病料，应是无菌采取的含病原微生物量高的血液、器官组织或分泌物和排泄物。因此要根据疾病的病性采取合适的病料，如无法估计是何种疾病时，应根据临床症状和病理变化采集病料或全面采取病料。取材时应注意病原微生物感染所致疾病的类型(如呼吸道感染疾病、胃肠道感染疾病、皮肤和粘膜性疾病、败血性疾病等)、病原微生物的侵入部位、病原微生物感染的靶器官等。细菌检验病料应当是采自未经抗菌药物治疗的
2、患病动物，并且应多做几张涂片。(2)适时采集 采集病料的时间一般在疾病流行早期、典型病急性期，此时病原微生物的检出率高；后期由于体内免疫力的产生，病原微生物减少，检测病原微生物比较困难，同时可能出现交叉感染，增加判断的困难性。在采集供抗体测定用的血清时，可适时地采集急性期和恢复期的两份血清样品，一般两份血清的间隔时间为142ld。内脏病料的采取，须于动物死后立即进行；夏季最迟不超过46h，冬天不超过24h，否则时间过长，由肠内侵入其他细菌，致使尸体腐败，有碍于病原菌的检出。供做切片的样品采取后必须立即投入固定液，否则时间过长，会使细菌和组织细胞死亡、溶解，影响检验结果。有条件做现场培养时，剖开
3、尸体后应进行接种培养，然后采样，最后剖检。(3)无菌操作 采集病料所用的器械及容器要进行严格的消毒：刀、剪、镊子等金属用具可煮沸消毒30min，使用前最好用酒精擦拭，并在火焰上烧一下；器皿（玻制、陶制及珐琅制等）在高压灭菌器或干烤箱内灭菌；软木塞和橡皮塞应高压灭菌；载玻片用2%5%碳酸钠煮沸消毒510min，煮沸后用清水冲洗干净，拭干保存或浸泡于95%酒精中以备使用；注射器和针头放于清洁水中煮沸30min即可，或用一次性注射器。病料采取过程都应该无菌操作，尽量避免杂菌污染。采取一种病料，使用一套器械，或器械酒精擦拭火焰灭菌后再采取另一种病料；一种病料放入一种容器，不可混放。(4)剖前检查 若有
4、突然死亡或病因不明的尸体，须先采取末梢血液制成涂片，镜检，观察是否有炭疽杆菌存在。若疑似炭疽时，不得进行解剖；如需要剖检并获取病料时，应经上级有关部门同意，选择合适的场地，做好严格的防范工作，剖后要进行严格的消毒处理。只有在确定不是炭疽后，方可进行剖检。2.病料采集的方法（1）液体材料 一般用灭菌棉拭子采取破溃的脓汁、鼻液、阴道分泌物与排泄物。未破的脓肿、胸水、腹水在皮肤表面消毒后，用无菌注射器抽取。（2）血液 无菌采取血液，供病原培养、抗体检测和血液检查之用。体型较大的单蹄和偶蹄类动物少量血样可以从耳背静脉采血；毛皮动物少量采血可通过耳壳外侧静脉采取；鼠类可以通过尾尖、耳背静脉、眼窝内血管采
5、血；兔可从耳背静脉、颈静脉、心脏等处采血；鸟类可以从肘关节内侧的翅静脉、跖部内静脉或心脏采血。（3）乳汁 乳房先用消毒药水洗净（取乳者的手也应事先消毒），并把乳房附近的毛刷湿，最初所挤的34股乳汁弃去，然后再采集10ml左右乳汁于灭菌试管中。若仅供显微镜直接染色检查，则可于其中加入0.5%的福尔马林液。（4）淋巴结及内脏组织 应在尸体解剖后立即采取。将淋巴结、肺、肝、脾及肾等有病变的部位各采取12cm 3的小方块，分别置于灭菌容器中，并尽可能采取有病变及病变交界处的部位。（5）胃肠及内容物 可将胃肠剪下，两端扎好，送往实验室。或用烧红的器具烧烙表面后穿一小孔，用灭菌棉拭子取其内容物，放入无菌的
6、器皿内或放入装有生理盐水或PBS的试管内。（6）脑、脊髓 按病理解剖方法取出脑、脊髓。取一部分放入10%福尔马林溶液的瓶中，供组织学检查；一部分放入50%甘油生理盐水瓶中，供微生物学检查。或者将头部取下，用塑料口袋包好直接送检。（7）胆汁 先用烧红刀片或铁片烧烙胆囊表面，再用灭菌细管或注射器刺入胆囊内吸取胆汁，置于灭菌试管中。（8）皮肤 去大小约1010cm 2的皮肤一块，保存于30%甘油缓冲溶液中，或10%饱和盐水溶液中，或10%福尔马林液中。（9）骨头 需要完整的骨头时，应将附着的肌肉和韧带等全部除去，表面撒上食盐，然后包于浸过5%石炭酸水或0.1%升汞液的纱布或麻布中，装于木箱内送到实验
7、室。(10)流产胎儿及小动物尸体 将流产胎儿及小动物尸体包入不透水塑料薄膜、油纸或油布中，装于木箱内送到实验室。二、病料的保存1.常用保存剂的配制（1）30%甘油缓冲溶液纯中性甘油 30mlNaCl 0.5g碱性磷酸钠 1.0g0.02%酚红 1.5ml中性蒸流水加至 100ml混合分装后，0.105Mpa高压灭菌30min（2）50%甘油缓冲盐水溶液NaCl 2.5g酸性磷酸钠 0.46g碱性磷酸钠 10.74g纯中性甘油 150ml中性蒸流水 150ml混合分装后，0.105Mpa高压灭菌30min（3）10%福尔马林溶液 取福尔马林10ml加入蒸馏水90ml即成。（4）饱和盐水溶液 取一
8、定的蒸馏水加入纯NaCl，不断搅拌至不能溶解为止（一般为38%39%左右），然后用滤纸过滤。（5）鸡蛋生理盐水溶液 先将新鲜鸡蛋的表面用碘酒消毒，然后打开内容物倾入灭菌的三角瓶中，加入灭菌盐水（占总量的10%），摇匀后，用无菌纱布过滤，然后加热至565830min，第2d及第3d按上法再加热一次，即可应用。2.常用保存方法（1）液体病料 检查抗体用的血液，不加抗凝剂，待凝血后，分离血清放入青霉素小瓶中。供病原分离培养用的液体病料，同容器一起放入有冰的保温瓶或4冰箱内。（2）供细菌学检验的实质脏器 若12d内能送到实验室，可放在有冰的保温瓶或冰箱内，也可放入灭菌液体石蜡或30%甘油缓冲盐水内。如
9、无冰，也可在保温瓶内放氯化铵500g加水1500ml，使保温瓶内保持O左右达24h。（3）供病毒学检验的实质脏器 应尽快送检，如不能即刻送检而需要保存时，必须保持在冷的环境中，48h内送到实验室。一般放在50%甘油缓冲盐水溶液或鸡蛋生理盐水溶液中，4保存最好，原因是冻化过程能使病毒破坏。如需保存较长时间才能进行检查，最好放在一20以下或干冰中保存。（4）病理组织病料 采取的病料立即放入10倍体积的10%福尔马林溶液或95%100%酒精中，如用10%福尔马林溶液固定组织时，经24h应重换新鲜液一次。神经系统组织（脑、脊髓等），需固定于10%中性福尔马林溶液内（福尔马林溶液的总容积中加入5%10%
10、碳酸镁）。在寒冷季节，为了避免病料冻结，在运送前，可将预先固定的病料置于含有30%50%甘油的10%福尔马林溶液中。三、病料的送检 供细菌检验用的病料，要防止腐败，必须及时送检。一般可用有冰块的保温瓶或其他低温条件，以使病料不腐败。最好由专人送检，并带好送检的有关病情、病例、剖检等记录，以供检验人员的参考。为避免散播病原，盛有病料的容器，瓶口要盖紧，用胶布封好或石蜡封固，并用消毒液充分擦拭容器的表面。瓶上加贴标签，注明样品来源、种类、保存方法、采集时间等。为避免病料外漏，应立放于金属筒内，填塞防震填充料(木屑、纸渣、稻草、塑料泡沫的渣屑等)。实验三 免疫接种一、目的 掌握免疫接种的方法和步骤，
11、熟悉生物制剂的保存、运送和用前检查方法。二、内容及方法（一）免疫接种的方法 按疫苗使用说明的方法接种，常用以下几种方法。1.注射免疫 操作简单，剂量准确。（1）皮下注射法部位：马、牛等大家畜在颈侧，猪在耳根后方，家禽在胸部、大腿内侧。先剪毛，用酒精或碘酒消毒，然后注入药液。优点：操作简单，吸收较皮内快。缺点：使用剂量多，反应较皮内大。用途：疫苗和免疫血清。（2）肌肉注射法部位：马、牛、猪、羊在臀部和颈部，家禽在胸部。先剪毛，用洒精或碘酒消毒，然后把针头刺入肌肉，注入药液。优点：操作简单，吸收快。缺点：一个部位不能大量注射，臀部接种不当时易引起跛行。用途：疫苗和血清。（3）皮内注射法部位：马在颈
12、侧、眼睑，牛羊在颈侧、尾根、肩胛中央，猪在耳根，鸡在肉髯。优点：用量较少，反应小（副作用小） ，免疫力高（同量与皮下相比） 。缺点：比较麻烦。用途：痘苗和诊断液。（4）静脉注射部位：马牛羊在颈静脉，猪在耳静脉，鸡在翼下静脉。优点：使用剂量大，见效快，可及时抢救病畜。缺点：比较麻烦，易引起过敏反应（接种异种动物血清时，即血清病） 。用途：免疫血清。2.皮肤刺种法 鸡新城疫、鸡痘疫苗常用此法接种，选定翅内侧无血管处，用刺种针或钢笔尖蘸取疫苗刺入。3.滴鼻或点眼法 用滴管吸取疫苗滴在鼻孔内或眼结膜。4.口服法用法：将疫苗混入饮水或拌入饲料通过饮水或采食经口免疫。必须注意，饮水免疫前要停水 46h，稀
13、释疫苗的水要纯净，尤其不能用含有消毒剂的水稀释疫苗；用于拌疫苗的饲料要新鲜，不宜用酸败或发酵饲料，大小动物要分开喂，使其能均匀吃到含疫苗的饲料；口服免疫前后 24h 不得饮用任何消毒药物，用活菌制剂时不能应用抗菌药物。优点：省时、省力。缺点：每头（只）剂量不准。5.喷雾法（1）使用仪器 气雾发生器。压力为 2kg/cm2（使 70%的微粒在 110um） 。（2）分类室内气雾免疫 动物进入室内，关闭门窗，喷头由门窗缝伸入，与动物头部同高，持续 2030min。室外气雾免疫 四周有矮墙的圈内，喷头与动物头同高，人员要走动，站上风，数分钟。（3）注意 操作者要防护自己，带大而厚的口罩穿工作服，胶靴
14、，如出现症状，及时就医。（4）影响因素 雾化粒子大小 110um ，如过大被鼻粘膜阻止，过小吸入后被绒毛运动排除；风力、风速；温度、湿度。（5）优点 省时、省力。适于大群动物免。（6）缺点 需要的疫苗数量多。（二）疫苗的保存、运送和用前检查1.疫苗的保存 按说明保存。一般弱毒疫苗保存在15以下，灭活疫苗在410。2.疫苗的运送 要求包装完善，防止碰坏瓶子和散播活的弱毒病原体，因此，运送疫苗，逐瓶包装，然后装箱。弱毒疫苗（活疫苗）一般要求“冷链”运送，即需要冷藏工具如冷藏车、冷藏箱、保温瓶等，以免其性能降低或丧失。严防在高温和日光下运输。灭活苗运送中也要防止冻结和曝晒。3.疫苗的用前检查 玻璃瓶
15、或安瓿应无破损，瓶塞应密封；瓶签上记载的名称、批号、有效期、容量、检查号码及使用方法等必须清楚；药品色泽及其物理性状必须和药品说明书上记载相符合，否则不得使用。(三)免疫接种的组织工作 接种时的组织工作是特别重要的，因为它可以决定全部措施的结果和成效。接种时组织工作如下：1.进行免疫接种时，应事先取得当地场、队等领导的支持，并商请给以人力物力等保证。并向有关人员宣传免疫接种的基本知识和注意事项等。2.组织好接种人员，准备好场地和保定工具。3.编订全部注射家畜的登记表册，进行编号，避免错乱而造成重复注射。（四）预防接种的注意事项1.根据当地传染病的发生和流行情况，选择适合本地的有效疫苗。2.接种
16、前应对接种畜群进行详细检查和了解，凡体质过于瘦弱、年幼、孕母畜（尤其是临产母畜） 、泌乳期母畜或产卵期家禽及有慢性病的，一般情况下均不应注射。3.准备好各种物品，如疫苗、注射器、针头、酒精、碘酊、脱脂棉、煮沸消毒器、登记表格等。注射针头尽可能做到每注射一头动物换一个针头，用完要经消毒后再用。吸取药品时，先除去封口上的火胶或石蜡，用酒精棉擦净瓶塞，然后把消过毒的针头插入，用注射器吸取药液。一次不能吸完时，不要把针头拔出，用酒精棉球包裹，以便继续吸取。不用已注射过的针头吸取，以免污染。注射工具(注射器、针头、镊子等) 用前要煮沸消毒。用毕后浸泡于消毒溶液内，时间至少 lh，洗净揩干用白布分别包好保
17、存。4.所用疫苗应按规定的稀释倍数用生理盐水、蒸馏水或瓶签上规定的稀释液进行稀释。稀释了的疫苗必须当天用完，否则废弃。5.接种弱毒活菌苗前后 5 天，停止使用对菌苗菌株敏感的药物。以免影响免疫效果。6.要做好预防接种的详细记录，包括接种日期、动物品种、年龄、数量、所用疫苗的名称、厂名、批号、生产日期及有效期、稀释剂及稀释倍数、接种方法、操作人员等。7.接种后，要注意观察畜群接种反应（包括正常的及异常的反应） ，如有不良反应或发病等情况，应根据具体情况采取适当措施（如治疗） ，疫苗接种经过一定时间后，应检查免疫效果，以便及时发现问题。8.工作人员注意自己的防护，需穿工作服及胶鞋，必要时戴口罩。工
18、作前后均应洗手消毒，工作中不应吸烟和吃食物。9.针筒排气溢出的药液，应吸积于酒精棉花上，并将其收集于专用瓶内，用过的酒精棉或碘酒棉和未使用完的药液等，应集中后烧毁之。实验四 药敏试验一、目的 要求掌握药物敏感性试验的操作技术，达到选择最适合的抗菌药物，用于疾病的治疗；了解某地致病菌的耐药性的变迁情况；识别真假抗菌药。二、原理 测定抗菌药物在体外对病原微生物的生长有无抑制作用的方法，称为药敏试验，有的以抑制细菌生长为评定结果的标准，有的则以杀灭细菌为标准。1.稀释法 以一定浓度的抗菌药物与含有被试菌株的培养基进行一系列的不同倍数稀释，经培养后观察最低抑菌浓度(minimal inhibitory
19、 concentration或 MIC)。常用试管法。2.扩散法 将浸有抗菌药物的纸片贴在涂有细菌的琼脂平板上，抗菌药物在琼脂内向四周扩散，其浓度呈梯度递减，因此敏感细菌在纸片周围一定距离内的生长受到抑制，形成一个抑菌圈。常用纸片法、挖洞法。三、材料与试剂1.含细菌的病料2.药敏纸片 购买标准药敏纸片；或自制药敏纸片：取直径 6mm 的无菌滤纸片，浸于一定浓度的抗菌药液（药液配制见表 ，根据需要稀释药液）中。一般每毫升药液中浸滤纸片 100 片，浸泡 12h 后干燥备用，药剂维持 12 个月有效。3.培养基 营养肉汤、营养琼脂、麦康凯琼脂（或 SS 琼脂） 。4.其他 灭菌棉拭子、试管、平皿、
20、酒精灯、铂金耳、镊子等。四、扩散法操作步骤（1）细菌分离、鉴定 将病料直接接种到麦康凯琼脂或营养琼脂，培养 24h，鉴别。（2）增菌培养 吊取 12 个菌落，接种于 2ml 液体培养基，37培养 16h 或 6h。（3）稀释培养物 培养 16h 的用生理盐水 1000 倍稀释，6h 的 10 倍稀释或不稀释。（4）涂菌 用灭菌的棉拭子蘸取细菌培养液或稀释的菌液，挤压，致密而均匀地涂布到培养基表面。（或用经火焰灭菌的接种环，挑取细菌的纯培养物（量要适当多一点），以划线接种方式涂布到培养基表面。也可挑取待试验细菌在少量生理盐水中制成细菌混悬液，再用灭菌的棉拭子蘸取菌液）。（5）贴药敏纸片 用灭菌尖
21、头镊子，镊取已制备好的各种干燥抗菌药纸片，分别贴到培养基表面（为了贴紧可用镊子按一下纸片）。纸片在培养基上的分布，一般在中央贴一种纸片，这样一只平板（90mm 2）可贴 67 个抗菌药纸片。如果药敏纸片没有标记，在每贴一种纸片后，应在平板底的对应部位上，用蜡笔药品名或贴上标签。（6）作用 将贴纸片的平板底部向上，置 37温箱内培养 24h,取出观察结果。五、结果与判定标准 经培养后，有抑菌能力的抗菌药物，在纸片周围出现一个无菌生长的圆圈，称为抑菌圈。抑菌圈越大，说明该菌对药敏感性越大，若无抑菌圈，则说明该菌对此药具有耐药性。判定结果时，应按抑菌圈直径大小（mm）来判定敏感度高低的标准。一般抑菌
22、圈直径 20mm 以上为极敏，1520mm 为高敏，1015mm 为中敏，10mm 以下为低敏，无抑菌圈为耐药。实验五 布氏杆菌病检疫一、目的 掌握平板和试管凝集实验的操作方法和结果的判定。二、试剂和材料抗原：由兽医生物药品厂供给。使用时用稀释液按说明书稀释，长霉或出现凝集块的抗原不能使用。待检血清：必须新鲜，无严重溶血和明显蛋白凝块，无腐败气味。血清采集后应在12d内送到实验室，不能按期送达者，需加入石炭酸防腐，每0.9m1血清加5%石炭酸0.1ml，立即震荡混合。阳性血清和阴性血清：由兽医生物药品厂供给。稀释液：0.5%石炭酸生理盐水，用化学纯石炭酸与氯化钠配制，经高压灭菌后备用。检疫羊时
23、用0.5%石炭酸10%NaCl溶液。其他 试管、吸管、玻璃板、火柴棒。三、操作方法 1.试管凝集反应（1）加稀释液 于试管架上置7支小试管，第1管加2.3ml、第25管加0.5ml 0.5%石炭酸生理盐水。（注：第一管理加0.5ml稀释液，待检血清直接是1：6.25的浓度。）（2）稀释待检血清及加阳、阴性血清 吸取待检血清0.2ml加入第1管中，吸吹混合3次后弃去1.5ml，再吸0.5ml移于第2管中，如前法吸吹混合3次吸出0.5m1加入第3管，此法稀释至第4管，混匀后弃去0.5ml。第五管不加血清为抗原对照。第六管加1:12.5的阳性血清0.5ml。第七管加1:12.5的阴性血清0.5ml。
24、（3）加稀释抗原 每管加入0.5%石炭酸生理盐水稀释抗原0.5m1，充分振摇混合。第14管待检血清的稀释倍数依次为1:25、1:50、1:100、1:200。（4）作用 置37温箱中感作4h，再移出放室温下1824h，然后观察并记录结果。（5）判定标准及结果判定 根据各管中液体的清朗程度和管底沉淀物的形状可予判定。+：液体完全透明，菌体完全凝集呈伞状沉于管底，为100%凝集。+：液体基本透明，略有混浊，菌体大部分被凝集沉于管底，为75%凝集。+：液体半透明，管体有明显的凝集沉淀，为50%凝集。+：液体透明度不明显或不透明，管底有不甚显著的沉淀或仅有沉淀的痕迹，为25%凝集。-：液体不透明，管底
25、无沉淀，不凝集。根据试验结果，可以确定血清的凝集价，以出现“+”以上凝集的最高血清稀释度为血清的凝集价。鹿、骆驼、牛等大动物凝集价1:100以上，狐、犬、羊等中小动物凝集价1:50以上为阳性。大动物l:50、中小动物1:25为可疑。可疑者半月后采血重检，2次可疑者判为阳性。（6）注意事项待检血清稀释时：牛、马、骆驼等大动物为1:50，1:100，1:200,l:400四个稀释度；猪、羊、犬等中小动物为1:25，1:50，1:100，1:200四个稀释度。大规模检疫时也可用两个稀释度，即牛、马、骆驼等大动物为1:50和1:100；猪、羊、犬等中小动物为1:25和1:50。2.平板凝集反应（虎红平板凝集试验） (1)取洁净玻板一块。(2) 吸取虎红抗原0.03m1和待检血清，用牙签混匀。(3)4-5min观察结果。 (4)结果判定+:出现大的凝集块，液体完全透明，即100%凝集。+:有明显的凝集片，液体几乎完全透明，即75%凝集。+：可见有凝集片，液体不甚透明，即50%凝集。+：液体混浊，有少量凝集颗粒，即25%凝集。-：液体均匀混浊。
